D-丙氨酸缺失时耻垢分枝杆菌中丙氨酸消旋酶对生长必需.pdfVIP

D-丙氨酸缺失时耻垢分枝杆菌中丙氨酸消旋酶对生长必需

摘要:丙氨酸消旋酶，由alr基因编码，是在肽聚糖生物合成中合成D-丙氨酸的一种重要

酶。发现耻垢分枝杆菌中的alr基因的缺失突变株需要D-丙氨酸才能在培养基中生长。这

表明，丙氨酸消旋酶是耻垢分枝杆菌细胞壁的生物合成中D-丙氨酸的唯一来源，并证实丙

氨酸消旋酶可以作为一个靶基因来开发抗分枝杆菌药物。

结核病是世界传染病死亡率领先的疾病。每年近200万人死于结核病，三分之一的世

界人口潜伏感染结核杆菌（6，35）。由于其对全球健康的重要性，研究者对抗结核药物的

识别和发展有极大的兴趣。一个具有显著历史价值的目标就是丙氨酸消旋酶（5,14,22）。

丙氨酸消旋酶是维生素B6的磷酸盐同型二聚体酶，其催化L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化，

是细菌细胞壁生物合成肽聚糖层中一个关键步骤。丙氨酸消旋酶通常不存在于真核生物中

但原核生物中普遍存在，这使得这种酶成为新型抗菌药物开发很吸引力的目标。

虽然D-丙氨酸对细菌细胞壁的形成至关重要，但确定是哪个基因对D-丙氨酸生物合成

途径重要是复杂的。细菌含有一个或两个丙氨酸消旋酶的基因。具有两个基因的物种，一

个是组成型表达和合成代谢，而另一种是诱导型和分解代谢（25-27）。这些基因提供细

胞壁生物合成所需要的D-丙氨酸，并通过敲除这些细菌的几个基因的研究确定，在无外源

D-丙氨酸时丙氨酸消旋酶对生长是必不可少的。某些细菌中，产生D-丙氨酸的另一种途

径，是利用D-氨基酸转氨酶。例如，在单核细胞增生李斯特氏菌中，dal和dat基因，分

别编码丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶，必须都失活以产生D-丙氨酸营养缺陷体

（29）。这也是事实，对于某些细菌具有一个D-氨基酸转氨酶，如枯草芽孢杆菌，丙氨

酸消旋酶在丰富和最小含量L-丙氨酸（2,8,28）培养基已被证明是必要的。

在分枝杆菌，关于丙氨酸的必要性的数据到目前为止仍有争议。耻垢分枝杆菌研究表

明，即使在D-丙氨酸缺乏时，丙氨酸消旋酶对生长是非必需（4）。在该研究中的丙氨酸

消旋酶基因插入失活。虽然这种失活不是致命的，但是突变显示大大降低增长能力和对D-

环丝氨酸的高度灵敏，这是丙氨酸消旋酶的一种抑制剂。该作者将意想不到的结果归于可

能存在另外一个D-丙氨酸的合成的替代的途径，有可能涉及D-氨基酸转氨酶。然而，随后

2

的耻垢分枝杆菌mc155基因组的公布却未能显示出任何显著同源性的D-氨基酸转氨酶。

另外，萨塞蒂等具有里程碑意义的研究，通过划定全基因组转座子插入失活所有生长所必

需的结核分枝杆菌基因，表明丙氨酸消旋酶明显对生长必需（21）。因为结核分枝杆菌和

耻垢分枝杆菌之间的这个意外的差异，而且由于最近耻垢分枝杆菌表现出极大的效用可代

替结核分枝杆菌用于抗结核药物的设计（1），我们决定重新研究这个问题。

耻垢分枝杆菌alr基因的缺失导致需D-丙氨酸才能生长。该ALR基因在耻垢分枝杆菌

2

mc155失活（23）是通过将其99％的编码序列替换为来自pUC18K的卡那霉素抗性编码序

列（表1）生长和诱变使用的标准协议的如先前所述（30）。所有常规克隆均在大肠杆菌

DH10B中进行，培养于初始pH7.0，37℃下在LB培养基或在LB琼脂板（20）。当需要

时，蔗糖加入10％到平板（重量/体积），和卡那霉素，潮霉素，和庆大霉素分别使终浓

度为25，50和5微克/毫升。alr基因的侧翼区（1,000bp）由PCR扩增分别使用的引物

对AlrKO1和AlrKO2和引物对AlrKO3和AlrKO4（表1）。由此产生扩增子的同时将卡那

霉素抗性序列（KpnI-HindⅢ片段含来自pUC18K的APHA-3）连接到含BamHⅠ-XbaⅠ转

移载体pPR23（19，30），这样就产生pDM2（图1）。敲除载体pDM2电转化到耻垢分

2

枝杆菌菌株mc155（0.2厘米间隙比色皿在2.5千伏，1,000Ω和25μF），然后在28℃下

筛选有卡那霉素抗性（Kanr）的菌落，复制温度敏感性载体。所得到的菌株（DM5）在

28℃下在补充有0