荧光定量pcr检测实验操作步骤.pdfVIP

荧光定量pcr检测实验操作步骤

实验方法原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光

基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，-后通过标准曲线对未知模

板进行定量分析的方法。

实验材料

细胞样品

试剂、试剂盒

RNA提取试剂盒荧光定量PCRMixTRIZOLdNTP氯-仿逆转录酶MMLV异

丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2琼脂糖溴化乙锭MOPS甲醛乙酸钠

EDTAEB溴酚兰

仪器、耗材

离心管离心机风光光度计电泳槽凝胶板RealtimePCR仪

实验步骤

一、样品RNA的抽提

1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

2.两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯-仿，

盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12

000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯-仿相，中间层

以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时

加入的TRIZOL试剂的60%。

3.RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异

第1页，共9页

丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000

rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶

状沉淀块。

4.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml

的75%乙醇〔75%乙醇用DEPCH2O配制〕，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000

rpm离心5分钟。

5.RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥

5-10分钟。

6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40ul用枪反复吹打

几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、RNA质量检测

1.紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释

〔1:100〕后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶

液浓度和纯度。

〔1〕浓度测定

A260下读值为1表示40ugRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：

A260x稀释倍数x40ug/ml。具体计算如下：

RNA溶于40ulDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495ul的TE中，测

得A260=0.21

RNA浓度=0.21x100x40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul

取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ul，剩余RNA总量为：

第2页，共9页

35ulx0.84ug/ul=29.4ug

〔2〕纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2.变性琼脂糖凝胶电泳测定

〔1〕制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10xMOPS电泳缓冲

液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。

10xMOPS电泳缓冲液

浓度成分

0.4MMOPS，pH7.0

0.1M乙酸钠

0.01MEDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，