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水产动物酶活性测定方法

一、分析样品的采取与处理

每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，

剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中

迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备

将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食

靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），

上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各

1.0g。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm

匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃

冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。

酶粉及饲料：

取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤

留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解,并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置

滤液待测。

三、酶活性测定

1.蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法

1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪

氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用

分光光度计测定。

1.2蛋白酶活性单位：

1克食靡或组织在30℃，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨

酸的酶量为1个酶活力单位。

1.3试剂

1.福林试剂（已配）

2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（NaCO）42.4g用水溶解和定容至1，

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000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为

1，000ml。

4.L—酪氨酸。

5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。

A：0.2mol/LKH2PO4(ml):50;

B：0.2mol/LNaOH(ml)29.63

C：水（ml）120.37

PH（20℃）：7.0

6．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入

少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却

后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过

多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使

用。

1.4标准酪氨酸曲线的绘制

1.将精确称取L—酪氨酸（先在105℃干燥2~3Hr）100mg小心地溶于60ml

0.1mol/LHCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级

别，一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L，该溶液含酪

氨酸100微克/毫升。