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无细胞蛋白表达系统研究进展

摘要:随着蛋白质组学研究的深入，无细胞表达系统备受人们重视。到目前

为止，来自原核和真核生物的无细胞表达系统已达十几种。本文就无细胞蛋白表

达系统的现状、应用及所面临的问题作一综述。

关键词:无细胞系统；蛋白表达;蛋白质组学

1引言

近年来，无细胞蛋白质表达系统再次受到关注。相比较体内表达，无细胞蛋

白表达系统具有其明显的优点[]，例如，不受细胞生理限制可进行较大量的毒性

蛋白表达；产物的活性和溶解性增加；产物不受胞内蛋白酶的降解；反应可以在

短时间内进行；无需繁杂的下游处理；适合于高通量表达。而且通过优化反应系

统，可以得到高产率表达产物。总之，在无细胞系统合成蛋白质可提高目标蛋白

的表达效果。

随着核酸测序技术、芯片技术和RNA干扰技术的建立和突破，人们对核酸

信息的了解越来越多。而生命过程最终多是以蛋白质形式执行其功能的，因此对

蛋白质结构和功能的研究成为后基因组时代重要的工作。因此，发展能够合成任

何目标蛋白系统以及实现高通量表达是当今生物技术中重要的课题。

2无细胞蛋白表达系统

无细胞蛋白质合成系统是一种以外源DNA或mRNA为模板，利用细胞抽提

物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、T7聚

合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统（如图一），1958年，Zamecnik

首次证明，从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成；1961

年，Nirenberg和Matthaei[4]利用蛋白质的无细胞合成体系，以破译遗传密码子。

该方法对蛋白翻译机制的研究，同样也作出了重要贡献。然而，当时由于此方法

的表达量有限，无法进行规模化生产，因此，在过去几十年一直没能被重视起来。

随着人们对蛋白质生物合成机制的深入了解，建立稳定的无细胞蛋白表达体

系已成为可能。现已确定，蛋白质生物合成的机器是核糖体，如果存在有tRNA，

以及蛋白折叠加工必需的酶和各种相关因子，只要提供外源的RNA模板、氨基

酸和能量，无需其他的细胞结构（如线粒体），蛋白质合成也能顺利进行。而在

各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因

子。因此，可以在无细胞体系中实现蛋白质表达，通过对无细胞反应体系的优化，

系统的稳定性和蛋白产率得到了大幅度的提高。

目前，已开发出来的无细胞表达系统有原核和真核系统两大类型。原核系统

通常是通过E.coliBL21(DE3)或其他敲除了内源蛋白酶和核酸水解酶的菌种，如

A19来进行无细胞表达体系的建立；真核系统，目前较为成熟的是利用兔网织红

细胞和麦芽提取物来实现无细胞蛋白表达系统的建立。理论上来说，任何遗传信

息都可以在这两大类体外表达体系中进行翻译而得到目的蛋白，但不同的系统有

着不同的特点，应该根据自己的需求来进行选择。

2.1原核系统

原核系统表达系统主要利用大肠杆菌的提取物来实现的。目前对大肠杆菌蛋

白合成机制已有十分详细的认识，这使得大肠杆菌的体外表达系统也随之不断得

到改进。大肠杆菌提取物基础上建立的无细胞蛋白表达系统有一个很大的优势就

是它的耐受性，它可以在含有其它不同成份杂质时仍可以进行目标蛋白的表达。

因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢物，

非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白

质。为此，该体系的弹性非常大，可以加入许多其它必要成份以提高产率和提高

溶解性。例如：微修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二

硫键，然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定的修饰，比如在丝氨酸和苏

氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是，蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍

然是一个问题，特别是利用这一系统合成那些多结构域构成和含有二硫键的真核

蛋白。不过，由于真核体外合成体系也未能解决蛋白质翻译后加工的问题，而大

肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高，因而依旧是体外表达的

热门选择。

2.2真核系统

2.2.1兔网织红细胞

兔网织红细胞是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化

而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未

成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，

而没有复杂的