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基于代谢组学分析海分枝杆菌对巨噬细胞的影响

【摘要】目的通过靶向代谢组学分析海分枝杆菌刺激巨噬细胞引起的能量代谢

和氧化脂质代谢变化，为了解巨噬细胞抵御海分枝杆菌感染的免疫机制提供线索。

方法从小鼠双侧股骨中获取小鼠骨髓来源巨噬细胞，培养后将其分为活菌组和

灭活菌组；采用临床分离培养的海分枝杆菌制备菌悬液，活菌组加活海分枝杆菌

刺激12h，灭活菌组加灭活的海分枝杆菌刺激12h。显微镜下观察两组细胞的形

态并测量巨噬细胞长度。收集两组细胞的裂解液，利用液相色谱串联质谱法检测

能量代谢物和氧化脂质代谢物。采用t检验比较组间巨噬细胞长度，采用主成分

分析、正交偏最小二乘法-判别分析等筛选差异代谢物。结果镜下可以见活菌组

巨噬细胞形成更多的肉芽肿样细胞聚集，灭活菌组巨噬细胞［（439.52±91.67）

µm］较活菌组［（289.96±70.11）µm］更细长，差异有统计学意义（P0.001）。

巨噬细胞能量代谢和氧化脂质代谢的主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析

均显示两组分离度好。能量代谢方面共发现12种差异代谢物，以氨基酸代谢变

化最为显著，其中瓜氨酸的含量明显升高，亮氨酸和丝氨酸的含量下降。氧化脂

质代谢方面共发现20种差异代谢物，以花生四烯酸代谢变化最为显著。结论

相较于灭活菌，海分枝杆菌活菌刺激的巨噬细胞氨基酸代谢和花生四烯酸代谢发

生改变，瓜氨酸代谢水平升高、亮氨酸和丝氨酸代谢水平降低、花生四烯酸类代

谢水平改变。

【关键词】海分枝杆菌；巨噬细胞；代谢组学；能量代谢；瓜氨酸；亮氨酸；丝

氨酸；花生四烯酸

海分枝杆菌是导致我国皮肤非结核分枝杆菌感染的最常见病原体之一［1］。

海分枝杆菌感染常表现为皮肤斑块、结节和丘疹，严重时可导致腱鞘炎、关节炎

或骨髓炎［2］。巨噬细胞是先天免疫细胞，在抗分枝杆菌感染中起重要作用。

分枝杆菌感染后，巨噬细胞通常会转变为病原体相关分子模式，并生成一氧化氮

（NO），结合先天或适应性免疫中淋巴细胞产生的γ干扰素（IFN⁃γ）一起发

挥防御作用［3］。巨噬细胞的激活与细胞代谢密切相关［4］，巨噬细胞在激活

过程中会对许多代谢途径进行重编程，以适应细胞功能的变化［5⁃6］，代谢物

对细胞内细菌感染具有天然免疫作用［7］。对海分枝杆菌感染的治疗过程中，

分枝杆菌很可能经历存活和灭活的状态变化，巨噬细胞可能发生不同的免疫应答。

因此，我们通过对活性和灭活海分枝杆菌处理的小鼠巨噬细胞进行液相色谱串联

质谱（LC⁃MS/MS）分析，检测两者差异表达的氨基酸和氧化脂质，探索巨噬细

胞抵御海分枝杆菌感染与代谢组学相关的免疫机制。

材料与方法

一、细胞、菌株来源

小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）来源于美国癌症研究所（ICR）小鼠双侧股

骨骨髓，该小鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号202

30802Abzz0619000993，动物实验许可证号SYXK（苏）2022⁃0017，SPF级屏障

环境饲养，6~8周龄，体重24~28g，雌雄不限。动物实验操作遵循《实验动物的

护理和使用指南》，本研究所涉及的动物实验已获得中国医学科学院皮肤病医院

伦理委员会批准（伦理批件号：2022⁃DW⁃025）。本研究所使用的海分枝杆菌

菌株为从中国医学科学院皮肤病医院临床海分枝杆菌感染患者中分离培养的临

床菌株。

二、主要耗材和仪器

MiddlebrookOADC增菌液、甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、异丙醇、氨水、乙

酸铵（德国Merck公司），Middlebrook7H9肉汤（北京索莱宝科技有限公司），

DMEM培养基、胎牛血清（上海逍鹏科技有限公司），100×青霉素/链霉素［生

工生物工程（上海）股份有限公司］，小鼠巨噬细胞集落刺激因子（mMCSF）（美

国PeproTech公司），红细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），Total

RNA试剂盒（美国Omega公司）。超声细菌分散计数仪（宁波新芝生物科技有限

公司），5424R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）、QTRAP™6500+LC⁃M

S/MS系统（上海SCIEX爱博才思分析仪器贸易有限公