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志不强者智不达，言不信者行不果。——墨翟

流感病毒分离标准操作规程(SOP)

病毒分离

分离病毒是诊断病毒性疾病最常用，并且高度敏感的方法之一。分离出的病毒须经免疫学、

基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、基因特性

或药物敏感性等分析。病毒分离亦受一定限制。目前用于分离病毒的组织细胞种类有限，每

种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。MDCK（狗肾细胞）是目前用于分离培养流感病毒

最常用的细胞系。

分离流感病毒最常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感

病毒。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。各实验

室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程

材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞

2、TPCK胰酶（牛胰腺来源XIII型）SigmaCat.#T-8642

3、HEPES缓冲液,1M母液GIBCOBRLCat.#15630-023

4、D-MEM培养基，GIBCOBRLCat.#11965-092

5、青、链霉素母液(10,000U/ml青霉素G;10,000µg/ml硫酸链霉素)，GIBCOBRLCat.

#15140-023

6、牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液，GIBCOBRLCat.#15260-011

7、放置于2mlwheaton小瓶中的临床样品

8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶，

细胞数量按规定调整。）

9、1ml滴管

10、10ml滴管

培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）

500mlD-MEM液中加入：

青、链霉素母液5ml(终浓度达:100U/ml青霉素and100µg/ml链霉素)

牛血清白蛋白12.5ml(终浓度:0.2%)

HEPES缓冲液12.5ml(终浓度:25mM)

病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5mlofTPCK-胰酶（母液浓度为

2mg/ml）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/ml。

方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全Ⅱ实验室中进行，必须遵守生物安全规定，

严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全Ⅱ实验室要求着必要的个人防护用

品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）

程序：

Ⅰ细胞培养瓶的准备

1、显微镜检查细胞生长状态，40倍放大。

2、用病毒培养液替代细胞生长液，保证使用合适的病毒培养基。

3、轻轻倒出细胞生长液于广口瓶中，用6mlof含2µg/mlofTPCK-胰酶的D-MEM液洗细

胞3遍。

Ⅱ细胞培养瓶的接种

志不强者智不达，言不信者行不果。——墨翟

1、用无菌的移液管将D-MEM从细胞培养瓶中移出。

2、用无菌的移液管吸取200µl临床样品置于细胞培养瓶中。

3、接种物37℃吸附30分钟。

4、加6mlof含2µg/mlofTPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于细胞培养瓶中。

5、每细胞培养物的收获日检测细胞病变。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增

大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落）

Ⅲ细胞培养物的收获