生化实验讲义：实验九 酵母蔗糖酶(最后).pdfVIP

君子忧道不忧贫。——孔丘

实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，

并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。

自1860年Bertholet从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已

被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）

（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖

苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖

水解，生成密二糖和果糖。

本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内

侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（externalyeastinvertase）,其活力占蔗糖酶

活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖

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酶（internalyeastinvertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，

两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它

们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。

尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，

本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要

是外酶。

两种酶的性质对照表如下：

底物底物

名糖含为蔗为棉等电最适稳定最适

称MW量亚基糖的子糖点pHpH温度

K的KpI范围

mm

外27万50%双26mM1505.04.9(3.53.0～60℃

酶(22万)mM～5.5)7.5

内13.5＜3%双25mM1504.5(3.56.0～

酶万mM～5.5)9.0

实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定

的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的

活力单位数。

本实验共有九个分实验：

一、蔗糖酶的提取与部分纯化

二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶

三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

四、反应时间对产物形成的影响

五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定

六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定

七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K和最大反应速度V的测定