大肠杆菌DNA聚合酶1的作用与应用资料.ppt

CompanyLOGOCompanyLOGO大肠杆菌DNA聚合酶I生物08220814151008肖乐大肠杆菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性35’-3’DNA聚合酶活性在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA链沿5‘→3‘方向延伸。3Mg2+,dNTP553DNA聚合酶I5’-3’外切核酸酶活性01从5→3方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5→3。023Mg2+50353DNA聚合酶I043’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA链，反应底物是带3-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3-OH端降解ds-DNA，可被53聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP抑制5Mg2+Mg2+,dNTP335DNA聚合酶IDNA聚合酶I活性能发生的反应切口平移置换反应活性01020304如果只有一种dNTP存在，35外切核酸活性将从3-OH端降解DNA，而53聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。5335外切酶活性53聚合酶活性置换反应切口平移首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移动，同时5’-3’DNA聚合酶活性又不断合成DNA。5Mg2+DNaseI35dNTP大肠杆菌DNA聚合酶I33’-端的末端标记切口平移法标记DNA合成cDNA的第二链应用1233’-端的末端标记先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端的带标记的DNA。CompanyLOGOCompanyLOGO