高考生物备考-考点75 蛋白质的提取与分离.pdf

1．蛋白质提取与分离的依据

分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度;吸附性质；对其他分子亲和力.

２．凝胶色谱法

（１)材料:凝胶

多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖.

（２）步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部

的通道,路程较长,移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在

凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3.缓冲溶液

(1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pＨ发生明显变化的溶液。

(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变.

（３）配制：通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成.调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同ｐH

范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如

HCO/NaHＣO，NaHＰO/NａHＰＯ等。

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（4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaHPＯ/NａHPO）,目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保

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证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察（红色)和科学研究（活性）。

４。电泳法

（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程.

（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不

同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离.

(3）类型:

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琼脂糖凝胶电泳法:由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质

的差异及分子的大小、形状的不同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入ＳDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质

－ＳDS复合物,使其迁移速度完全取决于分子的大小。

５。实验操作

实验操作的基本步骤:样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定.

（一)样品处理

（1)红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白.

②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。

③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水(质量分数为０．9％的NａＣl溶液）。

④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。

⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

(2）血红蛋白的释放:在蒸馏水和甲苯的作用下,红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3)分离血红蛋白溶液：（方法）离心。

试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：

①无色透明的甲苯层。

②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。

③红色透明液体：血红蛋白溶液层。

④暗红色沉淀层:红细胞破碎物沉淀。

(4)透析:

①方法：取１mＬ血红蛋白溶液装入透析袋,将透析袋放入盛有300mL物质的量浓度为20

mmol／L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析1２h。

②目的：去除样品中分子量较小的杂质.

③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。学科＆网

（二）凝胶色谱操作

（１)凝胶色谱柱的制作

制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管.

（2)凝胶色谱柱的装填

①材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。

②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡

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存在.然后用30０mＬ物质的量浓度为20mmol/Ｌ的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12ｈ，使

胶装填紧密。

（3）样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低