质粒dna的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题.pdfVIP

1．实验目的：

（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；

（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方式和技术；

2．实验材料及用品

（1）实验仪器（apparatus）：

恒温培育箱（Constanttemperatureincubator）、恒温摇床（Constanttemperature

shakingtable）、高速离心机（Highspeedcentrifuge）、漩涡振荡器（Vortexmixer）、

超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、

量筒（graduatedcylinder）、玻璃棒（stirbar）、微波炉（microwave）、天平（Pan

balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresistank）、电泳器

（Electro-phoresisSystem）、紫外灯（Ultraviolettransilluminator）

3）、材料与试剂（Reagents）：

①溶液I（SolutionⅠ）：

50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（）；10mmol/L

乙二胺四乙酸（EDTA）

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（SolutionⅡ）：新鲜配制，等体积混合

LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%SDS（可用10％贮存液稀

释配制）注意：SDS易产生气泡，不要猛烈搅拌。

③溶液III（SolutionⅢ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀

60mL5mol/LKAc，

冰醋酸，

H2O（该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）

④TE液缓冲液：10mmol/LTris-HCl（）；1mmol/LEDTA（）

⑤70%乙醇；

⑥平衡酚：氯仿1：1：

将量取25mlTris-HCl（）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，

移入棕色玻璃瓶中，4℃保留。

⑦LB培育基：

胰化蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl15g

pH

⑧琼脂糖（Agarose）；

⑨1liter（升）5×TBE备用溶液（stocksolution）：

54gtrisbase，硼酸（boricacid），20mlmol/LEDTA,pH；

⑩6×凝胶加样缓冲液：

%溴酚蓝（bromophenolblue），40%蔗糖（sucroseinwater）；

另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂

（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。

3．实验原理：

1）质粒DNA的提取：

（1）关于质粒：

质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的

DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要

性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，

可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大

的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。

（2）一般分离质粒DNA的方式都包括3个步骤：

①培育细菌，使质粒DNA大量扩增；

②搜集和裂解细菌