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转基因水稻TT51-1及其产品微滴式数字PCR定量检测方法

1范围

本文件规定了转基因水稻TT51-1及其产品微滴式数字PCR定量检测的原理、试剂耗材和主要仪器、操作步骤、数据分析、结果分析和表述及检出限。

本文件适用于转基因水稻TT51-1及其产品的定量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品成分检测抽样

农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

GOS基因GOSgene

一种根部表达的水稻基因，本文件中用作内标准基因。

3.2

TT51-1转化体特异性序列event-specificsequenceofTT51-1

TT51-1外源插入片段3′端与水稻基因组的连接区序列，包括转化载体的部分序列和水稻基因组的部分序列。

3.3

微滴式数字PCRdropletdigitalPCR

基于单模板分子PCR扩增并且对每个样品中的微滴逐个检测的一种核酸样品定量分析技术。3.4

阈值threshold

区分阳性微滴和阴性微滴的界限值。

4原理

采用水稻内标基因GOS和抗虫水稻TT51-1转化体特异性序列引物和探针，对测试样、TT51-1阳性对照、阴性对照及空白对照进行微滴式数字PCR扩增，根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样GOS基因和TT51-1转化体的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度copies/μL）。然后根据公式：转基因含量=（TT51-1拷贝数浓度/GOS拷贝数浓度）×100%，计算试样中转基因水稻TT51-1的含量。

5试剂耗材和主要仪器

5.1试剂耗材

微滴式数字PCR反应试剂盒、微滴发生卡、微滴读取油、微滴生成油、96孔PCR板。引物和探针见表1。

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表1引物探针名称、序列及片段大小

引物名称

产物大小

序列（5′-3′）

GOS-F

68bp

TTAGCCTCCCGCTGCAGA

GOS-R

AGAGTCCACAAGTGCTCCCG

GOS-P

HEX-CGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGG-BHQ1

TT51-1-F

120bp

AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG

TT51-1-R

GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA

TT51-1-P

FAM-CGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGG-BHQ1

5.2主要仪器

分析天平（0.0001g）、离心机、超微量紫外分光光度计、微滴发生器、微滴读取仪、普通PCR扩增仪、超纯水仪等仪器设备。

6操作步骤

6.1抽样

按农业部2031号公告—19—2013的规定执行。

6.2试样制备

按农业部2031号公告—19—2013的规定执行。

6.3试样预处理

按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。

6.4DNA模板制备

按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。

6.5微滴式数字PCR反应

6.5.1反应条件

在进行微滴式数字PCR反应时需同时进行试样、阳性对照、阴性对照和空白对照的PCR反应，每个PCR反应设置4次平行。

按照表2配制微滴式数字PCR反应体系，本文件用水符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

微滴式数字PCR扩增程序：1、95℃,5min（Ramp2℃/s）；2、95℃,30s（Ramp2℃/s）；3、58℃,1min；4、Goto2，39X；5、98℃,10min（Ramp2℃/s）；6、15℃,10min（Ramp1℃/s）。该程序为优化后的条件，可根据不同的酶作适当调整。

表2扩增反应体系

名称

储备液浓度

加样体积

反应浓度

DropletPCRSupermix

2×

10μL

1×

GOS-F

20μmol/L

0.9μL

900nmol/L

GOS-R

20μmol/L

0.9μL

900nmol/L

GOS-P

20μmol/L

0.25μL

250nmol/L

TT51-1-F

20μmol/L

0.9μL

900nmol/L

TT51-1-R

20μmol/L

0.9μL

900nmol/L

TT51-1-P

20μmol/L

0.25μL

250