可见分光光度法和紫外分光光度法.ppt

第十三章 紫外-可见分光光度法分光光度法(spectrophotometry)：根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。第一节 分光光度法的基本原理一、物质对光的选择性吸收

1、电磁辐射光 E=hμ=hc/λ 单色光：单一波长的光称为单色光， 复色光：由不同波长组成的光称为复色光。光红橙黄绿青兰紫波长780-620620-590590-560560-500500-480480-430430-380光的互补性：若两种颜色的光按适当的强度比混合可得白光，则这两种光称为互补色光。

2、物质对光的选择性吸收 M(基态)+h??M*(激发态)ΔE=E（激发态）-E（基态）=h? 只有当光子的能量(h?)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(?E)相等时，才能被吸收。处于同一直线上的两种色光为互补光。如蓝光与黄光互补，青光与红光互补等。

二、物质的吸收光谱吸收光谱：溶液对不同波长的光的吸收程度不同，以吸收程度（吸光度）为纵坐标，以波长为横坐标作图，所得曲线，即为吸收光谱或称吸收曲线。最大吸收波长：吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用?max表示。

三、透光率和吸光度I0IaItI0=Ia+It透光率的取值范围：0-100%T越大，溶液对光的吸收程度越小。

吸光度的取值范围：0~+∞ A愈大，溶液对光的吸收愈多。四、Lambert-Beer定律 A=εbc A：吸光度， b：吸收池厚度，单位，cm。 c：物质的量浓度（mol.L-1）ε：摩尔吸光系数，单位：L.mol-1.cm-1

例已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol?L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数。解由Lambert-Beer定律可得：

说明1：Lambert-Beer定律只适用于单色光。说明2：吸光度具有加和性。 A═A1+A2+A3+……例12-2测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下：A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，试计算每一组分的浓度。已知吸收池厚度为1.00cm。酶 ε(280nm)=2.96×104L.mol-1.cm-1 ε(260nm)=1.52×104L.mol-1.cm-1AMP ε(280nm)=2.4×103L.mol-1.cm-1 ε(260nm)=1.5×104L.mol-1.cm-1

解设酶和AMP的浓度分别为y和z ?为260nm0.58═1.52?104?1.00?y+1.5?104?1.00?z ?为280nm0.46═2.96?104?1.00y+2.4?103?1.00?z解方程得：y═1.4?10-5mol?L–1z═2.5?10-5mol?L-1答： 酶的浓度为1.4?10-5mol?L–1 AMP的浓度为2.5?10-5mol?L-1。

第二节 紫外-可见分光光度法一、分光光度计光源→单色器→吸收池→讯号处理及显示器1、光源：钨灯，可发出320~3200nm的连续光谱，最适宜的波长范围为360~1000nm。2、单色光器(monochromatro)3、吸收池：厚度有0.5、1.0、2.0、3.0、5.0cm等规格。

4、检测器：可见分光光度计用光电管、放大器、指示器。指示器一般有微安电表，记录器，数字显示和打印等。二、测定方法（一）标准曲线法配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定的波长处用同样厚度的吸收池分别测其吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标作图，可得一通过原点的直线，即为标准曲线。

（二）标准对照法用标准品配制一个已知浓度的标准溶液，在选定的波长处用同样厚度的吸收池分别测定标准溶液和未知溶液的吸光度，用计算公式求出未知溶液的浓度。

1、溶剂空白除被测物外无其它有色物质干扰时，可用溶剂作空白溶液。2.试剂空白按显色反应相同的条件加入各种试剂和溶剂(不加试样溶液)后所得溶液。3.试样空白不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的试样溶液。