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生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的测定液相色谱-串联质谱法

1范围

本标准规定了生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的定性及定量分析。

本标准生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的检出限均为0.1ng/mL(g)；定量下限均为0.5ng/mL(g)。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987，MOD）

GA/T122毒物分析名词术语

3原理

乌头碱、新乌头碱和次乌头碱在碱性条件下可用乙醚从生物检材中提出，然后用LC-MS/MS进行检测，经与平行操作的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品比较，以保留时间和两对母离子/子离子对进行定性分析。

4试剂和材料

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1对照品乌头碱、新乌头碱和次乌头碱纯度≥98%。

4.2乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品溶液的配制

分别精密称取对照品乌头碱、新乌头碱、次乌头碱各适量，用0.05%（v/v）盐酸甲醇溶液配成1mg/mL的对照品储备溶液，置于冰箱中冷冻保存，有效期为12个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得，冰箱中冷藏保存，有效期为6个月。

4.3硼砂缓冲液

pH9.0~9.2。

4.4乙醚。

4.5乙酸铵

色谱纯。

4.6甲酸

优级纯。

2

4.7乙腈

色谱纯。

4.8流动相缓冲液

20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液：分别称取1.54g乙酸铵和1.84g甲酸置于1000mL

容量瓶中，加水定容至刻度，pH值约为4。

5仪器

5.1液相色谱-串联质谱仪

配有电喷雾离子源（ESI）。

5.2分析天平

感量0.1mg。

5.3旋涡混合器。

5.4离心机。

5.5恒温水浴锅。

5.6移液器。

5.7具塞离心试管。

6测定步骤

6.1样品预处理

6.1.1血液、尿液

取血液或尿液0.5mL置于10mL具塞离心试管中，加1.0mL硼砂缓冲液后，用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心，将有机层转移至另一离心管中，置60°C水浴中挥干，残留物用200μL乙腈:流动相缓冲液(70:30)溶解，供LC-MS/MS分析。

6.1.2组织

将组织剪碎或匀浆，称取0.5g置于10mL具塞离心试管中，加1.0mL硼砂缓冲液浸泡半小时后，用乙醚3mL提取，以下同6.1.1项下操作。

6.2样品测定

6.2.1液相色谱-串联质谱参考条件

a)色谱柱：CapcellPakC18柱(250mm×2.0mm×5μm)或相当者，前接保护柱；b)柱温：室温；

c)流动相：V(乙腈):V(20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲溶液)=70:30；d)流速：200μL/min；

e)进样量：5μL；

f)扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

g)检测方式：多反应监测（MRM）；

h)离子喷雾电压：5500V；

i)离子源温度：500°C；

j)每个化合物分别选择2对母离子/子离子对作为定性离子对，以第一对离子对作为定量离子对。其定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和保留时间（tR）见表1。

乌头碱、新乌表1

乌头碱、新乌

头碱、次乌头碱的定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量

3

(CE)和保留时间（tR）

名称

英文名

定性离子对/

(m/：)

DP/

(V)

CE/

(eV)

tR/(min)

乌头碱

aconitine

646.4/586.1*

646.4/526.2

100

46

51

3.03

新乌头碱

mesaconitine

632.3/572.2*

100

46

2.82

次乌头碱

hypaconitine

632.3/354.2616.4/556.2*

616.4/524.0

100

58

45

48

3.13

注：*定量离子对

6.2.2定性测定

进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加目标物对照品的色谱峰保留