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利用荧光显微技术研究生物单分子陈浩200425023分析化学专业光学单分子方法的进展近20年来,光学探测方法有了长足的进步。在80年代出现并逐渐成熟起来的近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基本手段,同时也使光学显微术进入了纳米科学的领域。而共焦显微术不仅突破传统光学的衍射极限,而且为光学探测引入了第三维空间信息,使光学探测具有了层析能力,实现了真正的空间三维成像。超短脉冲激光技术直接导致了多光子荧光显微术的成功。尤其是飞秒激光激发的荧光显微术,对于提取时间分辨的信息是有力的工具。这种荧光单分子探测及单分子光谱探测与其数据处理方法的组合,形成了荧光共振能量转移的探测方法。通过该方法可以获得1.5纳米～8纳米的空间分辨率的构像信息,达到光学方法上最高的分辨率。以上近场、共焦、荧光显微术和荧光共振能量转移四种基本技术构成了目前活跃的生物单分子探测的光学平台。MyosinV的分子结构肌球蛋白是包含18个不同子类的一大类蛋白分子马达，但构型上都属于二聚体，有两个明显伸出的“头”，用于附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。MyosinV的两种运动模型在Hand-over-hand模型中，后腿向前移动了74nm，而前腿没有移动。分子本身移动了37nm，染料移动了37±2xnm，(如果MyosinV的结构是不对称的，x为染料到轴的平均距离)。在inchworm模型中，myosin分子的所有部份都向前移动37nm，并且有一个头始终与肌球蛋白丝结合在一起。单分子荧光技术检测运动模型具体检测技术：全内反射荧光显微＋共聚焦荧光显微把一个荧光分子标记在myosinV的一条腿上，再用荧光显微镜来对标记的荧光分子进行检测。据此来研究myosinV的迈步过程。远场和近场光学检测主动或被动发光的原因是物体受激发之后,内部电偶极跃迁引起电磁场的辐射,电磁波从物体表面向自由空间传播。单击此处添加小标题物体表面以外的场分布可以划分为两个区域:距物体表面仅几个波长内区域,这一区域称为近场区域;近场区域以外到无穷远是远场区。单击此处添加小标题常规激发和收集均处于远场区域。在远场区域只存在可以向无穷远传播的远场波(也称为辐射波)。近场区域光场包括了限于表面仅几个波长内存在的成分,即近场波(也称为非辐射波);又包括远场波。近场波也被称为衰逝波,(隐失波),其强度随离开表面距离指数衰减,不能在自由空间存在。近场波体现了光在传播过程中,遇到空间光学性质不连续时,光波的空间瞬态变化,这种变化很快在空间衰减,它反映了空间光学性质的不连续性。单击此处添加小标题全内反射显微光在光密介质中传输,如果它以大于临界角的角度入射到另一个折射率较小的介质上,光就会发生全反射。。实际上,即使当角度Hc,仍然会有一小部分能量以隐失波的形式穿透到液体介质中,在“近场”情况下,光沿平行界面传播。由全内反射产生近场激发照明之后,利用共焦或宽场去取像,即构成荧光标记全内反射荧光显微镜。全内反射显微术典型的垂直照明深度100nm。这么薄的光学层析层切片意味着信噪比比共焦系统好得多,细胞的光损伤和光漂白也很小。其图像是通过CCD相机来捕获的。这种仪器很灵敏或成像速度很快(但很少有CCD相机兼有以上两个优点),目前可达到的量子产率已到～80%,成像速率～200帧/秒。12共聚焦显微在光学成像系统中利用两个焦点来生成物体的象。一个焦点为使用显微镜物镜把入射的激光在物体表面或内部形成的。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它可以是反射的光，也可以是物体受激发发出的荧光。这一象点再通过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了第二个焦点。这两个焦点是共轭的（共焦）。通过沿x或y方向一点点地生成象点，综合成平面图像，再调节z方向生成象点，通过计算机合成三维图像。所以共焦显微镜具有对细胞和光漂白区域进行深度三维成像的能力。Hand-over-handVSinchworm纳米精度荧光成像技术FIONAFluorescenceimagingwithone-nanometeraccuracyinchworm模型预测每步的长度应该是37nm，分子本身移动也是37nm；而hand-over-hand模型观测长度应该是分子本身移动位移的两倍――也就是74nm。为了测试这两个运动模型，科学家开发了一种单荧光分子成像技术来定位，误差可以小于1.5nm，并具有0.5秒的时间分辨率。同时可以拍摄几分钟的影像来观察。全内反射荧光显微(TIRF)用来激发多个单个的荧光分子，并使用CCD来拍摄帧逐帧连续图像（不存在帧间的失效时间）。单纳米精确荧光成像(FIONA)技