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第33卷分析化学(FENXIHUAXUE)评述与进展第7期

2005年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1029~1035

磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用

王京兰钱小红*

(军事医学科学院放射医学研究所,北京100850)

摘要磷酸化修饰蛋白质的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对于目前磷酸化蛋白质分析所涉及的各

种方法,包括放射性同位素标记,抗体免疫印记等传统方法和以串联质谱各种扫描技术为基础,结合亲和提

取、液相色谱2质谱联用等手段的新技术、新方法,以及这些技术在磷酸化蛋白质组学中的应用予以评述。

关键词磷酸化修饰,蛋白质组,生物质谱,评述

1引言

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有

1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去

磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基

团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质

的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经

活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动,目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷

酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[1]。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所

具有的重要意义,探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家

所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰,可以从整体上观察细胞或组

织中磷酸化修饰的状态及其变化,对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个

重要的补充,并提供了一个全新的研究视角,由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)这一新

概念。规模化的识别和鉴定生物体内磷酸化蛋白质的表达及其变化,在技术方法上还存在很大问题,其

中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一。细胞内仅有少部分

蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难,

一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的10%[2]。

本文将对目前磷酸化蛋白质分析所使用的多种技术进行介绍和评价,包括传统的放射标记、抗体应

用技术及新兴的各种磷蛋白/肽的富集技术和高灵敏度的质谱检测技术,并结合应用实例对这些技术在

磷酸化蛋白质组学中的应用予以综述。

2磷酸化蛋白质检测方法

32

2.1[P]放射性标记

3232

[P]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[P]标记磷酸盐作为磷

32P]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化

酸基团供体,被[

蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水

解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定

[3]32P]代谢标记

磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年,Arrigo等就采用[

和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白

hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸

[3]32P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结

化程度会显著降低。[

2003210212收稿;