免疫学实验技术.pptVIP

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂（immunosorbent）；酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。常用ELISA方法直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。间接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后加入待测抗体，再加入酶标抗体。与直接ELISA相比，间接ELISA适用的范围更为广泛，并且特异性也较好。夹心ELISA：使用俘获抗体（包括单抗和多抗）包被微量滴定板，其余步骤同间接ELISA。根据包被抗体种类的不同，又可以分为同种单抗夹心ELISA，异种单抗夹心ELISA，多种单抗混合夹心ELISA和多抗夹心ELISA等几种方法。与间接ELISA相比，夹心ELISA多了一步以抗体俘获富集抗原的过程，因而其灵敏度和特异性也相应提高。但是对有些病毒的株系，夹心ELISA并不是很好的选择。这可能与单克隆抗体识别的是蛋白亚基的抗原表位还是病毒粒子表面的抗原表位有关包被01封闭02孵育03洗涤04显色05结果测定06基本步骤基本步骤包被：将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。包被条件：包被液：pH9.6碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、pH7-8的Tris-HCL缓冲液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定，没有绝对的选择，但有一个原则就是要尽可能的保持包被物的活性不被损失。目前常用的包被缓冲液有PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液等，一般来说，缓冲液的pH要大于蛋白质的pI，以保持其活性。碱性包被液如碳酸缓冲液用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易与板子结合。也有用PBS和柠檬酸缓的，但是比较少见。洗涤：清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。常用的洗涤液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液，洗涤3次，5min/次。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。封闭：封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而避免ELISA后续步骤中抗原或抗体与固相载体的直接吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封闭。孵育：抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育，通常37℃孵育0.5-1h。应注意孵育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。显色：于各反应孔加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃反应10-30min。显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。结果测定：于各反应孔加入2M硫酸0.05ml，终止反应；拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。于450n