马冷冻精液生产技术规程（征求意见稿）.docx

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马冷冻精液生产技术规程

1范围

本文件规定了马冷冻精液生产过程及对实验室准备、采精、精液检查与处理、精液冷冻、冻精检测、包装、冻精、贮存及运输的技术要求。

本文件适用于马冷冻精液的生产。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T5458液氮生物容器

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

假台马fakemaretable

人工采精时供公马爬跨的模拟母马。

3.2

假阴道fakemarevagina

模拟母马阴道环境条件的采精工具，由外壳、内胎、漏斗、集精杯、气阀等组成。

3.3

稀释液semendiluent

保护精子延长其存活时间及增加精液容量的液体。

4实验室准备

4.1玻璃器皿

玻璃器皿使用前先用自来水浸泡，再用加有中性洗涤剂的温热溶液刷洗两次后冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2次，洗净后的玻璃器皿应光亮、内壁无水滴附着。

将洗净的玻璃器皿送入电热干燥箱，加热至160℃后恒温60min,然后温度调至38℃备用。

4.2一次性耗材

采精前1h将一次性无菌耗材放入38℃无菌恒温干燥箱备用。

4.3假阴道

安装好内胎，橡皮圈固定两端；冲洗表面污物，再用中性洗涤剂的温热溶液刷洗并冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗。将洗净的假阴道放在架子上，覆盖两层清洁纱布，晾干备用。

4.4器械消毒

接触精液的器械应清洁无菌，根据材质和现场条件选择以下适合的消毒方法：

——煮沸消毒：适于玻璃、金属、塑胶器械及溶液消毒，在消毒过程中，消毒的器械应浸入水中，温度升至100℃后煮15min取出，稀释液、冲洗液应水浴消毒，温度升至100℃后煮20min取出，塑料、橡胶器材应在水沸腾后立即取出；

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——火焰消毒：适于金属、玻璃器材。用酒精灯灼烧，待降温后用0.9%生理盐水冲洗后备用；

——酒精消毒：适于玻璃、橡胶、金属器材,用75%酒精擦拭，待酒精挥发后用生理盐水冲洗干净，器材在使用前再次用生理盐水冲洗；

——专用设备消毒：使用高压灭菌锅、高温干燥箱、消毒柜消毒。

4.5仪器设备

采精前1h，恒温水浴锅水温设置为38℃;显微镜载物板温度调至38℃。

4.6配制稀释液

稀释液的配制方法见附录A。

4.7实验室

采精前2h，擦拭操作台，清洁实验室地面，后用紫外线消毒灯45min。

5采精

5.1采精前准备

5.1.1采精场所

采精场地应宽敞平坦、安静卫生，地面干净、防滑。

5.1.2种公马

种公马的阴茎及包皮用40℃的2%碳酸氢钠液擦洗，40℃开水冲净后用消毒纱布擦干。

5.1.3假阴道

假阴道内套一次性塑膜内衬并固定，向假阴道内胎夹层灌入50℃~55℃的温水，为其容量的1/3~1/2，使其在采精时温度保持38℃~42℃。在假阴道入口前1/3段，用玻璃棒均匀涂抹甘油或凡士林。内腔充气，呈“Y”或“X”字型，入口宜为较浅的漏斗状，连接三角漏斗、集精杯，套假阴道保护套。

5.2采精

5.2.1诱情

采精前，性兴奋不足的公马应采取诱情措施，提高其性欲。牵一匹温顺的发情母马，站于假台马前方，诱使种公马产生性欲，在假台马后躯涂抹发情母马的阴道分泌物或尿液，诱使种公马产生性欲并爬跨假台马。

5.2.2采精

饲养员牵引种公马先让其空爬，后转圈，数次后，公马阴茎勃起时，饲养员站于台马左前方，采精员站于台马右前方。种公马爬跨后，采精者迅速上前，右手持假阴道（假阴道口斜向下方，与假台马呈30°~35°夹角），左手轻握公马阴茎中前部，左右手配合将公马阴茎自然引入假阴道口内。公马完成射精时，采精者握紧假阴道，随公马身体一同移动，待公马前肢落地时，缓慢取下。假阴道取下后保持竖直，使精液尽快流入集精瓶内。取下集精瓶并迅速送至实验室处理。

6精液检查与处理

6.1气味、色泽

正常精液略带腥味，颜色为淡乳白色或淡灰白色，气味、色泽异常时，应废弃。

6.2精液量

可通过集精杯内壁刻度直接读取精液量，也可从将精液迅速用灭菌纱布过滤至刻度瓶中，除去精液内的胶状物后再读取精液量。

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6.3镜检

用移液器取精液于载玻片上，加盖玻片在恒温装置38℃的显微镜下评定活力，镜检活力合格者进行密度分析。精子活力≥70%，精子密度≥1*109个/ml，精子畸形率≤10%，不合格者应废弃。

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