生物药物分离技术：细胞色素C洗脱液的盐析PPT教学课件.pptx

项目二细胞色素C的生产任务六细胞色素C洗脱液的盐析

严格遵守GMP和执行细胞色素C盐析岗位GMP，以人造沸石的25%硫酸铵洗脱液为原料，通过加入固体硫酸铵到45%，使杂蛋白析出，过滤后收集到红色透亮的细胞色素C滤液。规范填写生产记录。任务描述细胞色素C洗脱液的盐析2

任务支撑（一）细胞色素C盐析的目的与作用盐析法可将加盐后溶解物质与析出沉淀分离，还阶梯式提高盐浓度，可用于将不同盐浓度下析出的蛋白质分开。在前面的操作单元中，对细胞色素C的提取液分别进行了等电点沉淀除杂以及人造沸石吸附除杂，初步地对提取液中的杂蛋白进行分离。本任务利用固体硫酸铵对细胞色素C与杂蛋白进行分离。3细胞色素C洗脱液的盐析

（二）盐析法4盐析法又称中性盐沉淀法，其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。盐析法原理

（1）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜在蛋白质等生物大分子表面分布着亲水基团，如-COOH、-NH2-OH等。这些基团与极性水分子相互作用形成水膜，中性盐抢夺蛋白质分子结合的自由水，水化膜层减弱乃至消失，暴露出蛋白质的疏水区域，蛋白质的溶解度也会随之减小。（2）中性盐离子中和蛋白质表面电荷盐离子与蛋白质表面具有相反电荷的离子基团结合形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，蛋白质分子之间的排斥力作用减弱，从而使蛋白质分子之间聚集而沉淀析出。（二）盐析法盐析法原理5

（二）盐析法用盐选择盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济★盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1）价廉（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好（4）不易引起蛋白质变性6

盐析影响因素（二）盐析法盐的饱和度（离子强度）影响蛋白质盐析的重要因素不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加pH值在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出蛋白质浓度在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用温度一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件7

硫酸铵加入方式（二）盐析法1.加入固体硫酸铵法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况在粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来应注意添加硫酸铵的速度，通常是在搅拌条件下，以少量多次方式加入8

9为方便起见，在室温及℃时所需固体硫酸铵的量可直接查表（二）盐析法室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数

10（二）盐析法为方便起见，在室温及℃时所需固体硫酸铵的量可直接查表0℃下由S1提高到S2时每100ml加固体硫酸铵的克数溶液的原始饱和度/%饱和度在0℃时所达到硫酸铵饱和度（%）20253035404550556065707580859095100在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.46.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.22002.75.58.311.314.317.520.724.127.631.234.938.742.746.951.255.72502.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.23002.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.240.244.548.83502.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.34002.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.84502.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.35003.06.09.212.515.919.423.026.830.834.85503.06.19.312.716.119.123