免疫组化与原位杂交.pptVIP

1.免疫荧光双重染色1)直接法：直接用不同荧光染料标记的两种抗体孵育标本。如用FITC-CD45antibody（绿色）和Alexaflour555-CD20antibody（红色）检测淋巴组织中的T细胞和B细胞。优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主（host）的抗体。缺点：敏感性低。2)间接法:①第一抗体来源于非同一种属,可用以下方法：A)先用各自非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的各自二抗结合一抗。二抗可以是来源于同一种属，也可以不是。如：一抗:mouseanti-CD45rabbitanti-CD20二抗:FITC-goatanti-mouseIgGTRITC-goatanti-rabbitIgG(green)orTRITC-donkeyanti-rabbitIgG(red)优点：增加了敏感性。缺点：需用3-4种抗体，且一抗不能来源于同一种属。由于所用的抗体来源于不同种属，存在交叉反应的可能性，使用前需进行种属间的交叉实验。B)也可先完成第一套抗体显示第一抗原，再进行第二套抗体显示第二抗原。②第一抗体来源于同一种属，可采取以下方法进行：A)在完成第一套抗体显示第一抗原及保存了相应的图像后，用微波处理灭活第一套抗体，再进行第二套抗体显示第二抗原。两套二抗可以是来源于同一种属，也可以不是,但须标记不同荧光染料。B)在完成第一套抗体显示第一抗原后，用饱和的与第一套一抗同一种属的免疫球蛋白封闭第一套抗体中二抗的未结合位点，再用荧光标记的第二套一抗直接进行第二抗原的显示。2.免疫荧光多重染色理论上可以使用N个不同荧光染料标记的抗体检测N个不同抗原，实际使用上受荧光显微镜设置的荧光通道限制。通常荧光显微镜最多只能设置3-4个荧光通道。1)直接法：可直接用3个或3个以上不同荧光染料标记的一抗显示相应的抗原。2)间接法:优点：可在一标本上检测3个或3个以上不同的抗原。缺点：由于不同种属来源的抗体间存在交叉反应的可能性大，非特异性反应极高。①第一抗体来源于非同一种属，可用以下方法：A)先用3种或3种以上不同种属的非标记一抗孵育标本，再用不同荧光染料标记的二抗各自结合一抗，一抗和二抗间不能有来源于同一种属的抗体。B)也可按先后顺序进行各套抗体显示各自抗原。②第一抗体来源于同一种属：可在完成每套抗体显示各自抗原及保存了相应的图像后，用微波处理灭活各套抗体,再进行后续不同荧光的各套抗体显示后续的各个抗原。此方法的前提条件是后续的各个抗原能耐受微波处理。二）免疫酶双重及多重染色前提条件：必须预先去除内源性因数（如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和素等）的影响。应该提醒的是，目前尚无方法去除内源性生物素和亲和素。1.免疫酶双重染色1)直接法：先去除内源性因数(如过氧化物酶，碱性磷酸酶，生物素，亲和素等)的活性,再加不同的酶标记的抗体,以各自抗体标记酶的底物反应显示抗原的分布。如用HRP-CD68antibody和AP-CD105antibody检测炎症组织中的巨噬细胞和中性粒细胞,分别以DAB(棕色)和fastred（红色）显色。优点：特异性高，方法简单，可用来源于同一宿主的抗体。缺点：敏感性低,必须用不同的标记酶及底物。2)间接法:优点：敏感性高。缺点：特异性低。①第一抗体来源于非同一种属，可用以下方法：A)先用各自非标记一抗孵育标本，再加不同酶标记的二抗系统(如HRP-polymer和AP-polymer,SP-ABC和SAP-ABC)及酶底物显示各自抗原。二抗系统可以是来源于同一种属，也可以不是，但必须标记不同的酶。B)也可先完成第一套抗体系统显示第一抗原，再进行第二套抗体系统显示第二抗原。它们的二抗系统可以是来源于同一种属，也可以不是，但必须标记不同的酶。C)如欲使用PAP和APAAP的二抗系统，则二抗系统之间及二抗系统与一抗之间不能有来源于同一种属的抗体。②第一抗体来源于同一种