优化蛋白质免疫印迹WesternBl.pptxVIP

优化蛋白质免疫印迹WesternBlot符修乐01WesternBlot基本原理02WesternBlot一般流程03WesternBlot优化条件的选择

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法定义

WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

转膜一抗杂交底物显色蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳封闭二抗杂交12345WesternBlot一般流程

WesternBlot（间接）一般流程:

SDS凝胶的配制和加样01转移膜的选择02封闭条件的选择03抗体浓度的确定04标记二抗的注意事项05洗涤条件的改善06检测方法的选择07WesternBlot可优化条件：

不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。01SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）02

灌制分离胶隔绝空气加水液封

灌制积层胶插入梳子

凝胶浓度与蛋白分离范围选择正确的凝胶浓度百分比按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212

条带呈笑脸状凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温度偏高。拖尾样品溶解不好条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜。条带呈皱眉状可能是由于装置不合适，特别是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。条带两边扩散加样量过多123456（2）避免电泳中出现以下情况

凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，放置加样孔出现不平。拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲。样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度。每个加样孔体积应一致，防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压。上样量太大及电压太高都会导致不正常条带的出现。32145需要注意：

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。目前常用比色法测定样品蛋白的含量，Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法（二喹啉甲酸法）等。但各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。其中上样蛋白量不应超过30ug/mm2（载荷面即：如果胶槽是5mm×1mm，则载荷面1mm×5mm=5mm2)。123（3）要测定蛋白浓度，且加样量均匀，

2.转移膜的选择（1）最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。（2）膜的选择主要根据：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

NC膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。01PVDF膜：与蛋白质亲和力高，物理强度，以及具有更好的化学兼容性，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。02NC膜与PVDF膜特性：

三种膜的比较

为避免作为检测试剂的特异性第一抗