第四章核酸电泳与检测ppt课件.pptxVIP

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2025-01-11 发布于北京
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第四章核酸电泳与检测ppt课件.pptx

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;;1.基本原理;;;;不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围;;2.影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：;;;;;;;3.琼脂糖凝胶电泳;;;;;;（2）琼脂糖凝胶中DNA的检测;;（3）EB使用时的配制、贮存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5μg/ml。

（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。

;EB替代品;;;（3）结果分析;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中

DNALadder的形成;;4.注意事项;5.常见问题与对策;;;;6.DNA浓度和纯度的测定;（2）分光光度法

DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。

波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02

当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml

??????????????ssDNA浓度约为37μg/ml

??????????????RNA浓度约为40μg/ml

??????????????寡核苷酸浓度约为30μg/ml（由于底物不同有差异;;;操作步骤

1、?UV-240紫外分光光度计开机预热10min.

2、?用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。

3、?设定狭缝后校零。

4、?将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。

5、?把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。

6、?设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。

7、?计算待测样品的浓度与纯度。

DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000

RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000;;基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。;