免疫组化基本技术.ppt

内源性酶的消除方法

内源性过氧化物酶的消除方法：

0.3%～3%H2O2甲醇液20min

1％H2O220min

3％苯肼溶液37℃1h

0.075%盐酸甲醇液30minDAB-H2O2溶液中加0.005MNaN3过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min，经洗后1％硼酸钠处理10min。20mol/L-100mol/L抗坏血酸30～60min。01内源性碱性磷酸酶的消除方法030.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0）20min0210％醋酸10min041mol/L左旋咪唑20min用2-甲基-D苷露糖饱和生物素01先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。02(三)内源性生物素的消除方法酶消化和抗原修复12固定液的影响自1893年FerdinandBlum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。3为什么要进行酶消化和抗原修复？目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。01甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。02抗体制备的影响去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白断交联酶消化

原理：蛋白酶的种类01胰蛋白酶0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1NNaoH调pH至7.8。消化时间37℃30min。02胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时间37℃30～180min。01蛋白酶K20μg/ml，用pH8.00.5MTris-HCI配制，消化时间37℃20～40min。02链酶蛋白酶0.1%，用pH7.4,0.5MTris-Hcl稀释，消化时间37℃1～4h。01无花果蛋白酶0.1%浓度，用0.2MpH7.4PBS稀释，消化时间37℃30～60min。02胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。01在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值，消化温度、浓度和孵育时间。02(3)原则及注意事项热诱导的抗原修复：抗原修复(AntigenRetrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃，15min；③水浴锅100℃，15min；④高压锅/消毒锅120℃，5min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。修复介质：①0.01MpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01MpH7.0PBS;④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：①100℃20min；②90℃40min；③80℃60min；④70℃20h。选择最佳的修复方法12AR应注意的问题：高温AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用AR后，却能很好地表达；某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：热处理后应注意自然冷却；

热处理液不要让其煮干；

不要任何抗原的检测都使用该方法；

一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；12形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EG