基因工程的基本技术.ppt

PCR操作流程94℃50℃72℃?2、PCR反应过程：变性：DNA双链变为单链；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。?3、PCR反应体系：体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）。一般成对出现，长度为15-30个核苷酸；使用浓度：，高达1uM；引物设计原则：1G+C含量45-55%；2Tm值高于55；3引物特异性；4引物扩增跨度；5是否形成引物二聚体61）、引物（寡聚核苷酸）模板DNA：Taq酶(热稳定性)：反应缓冲液成分：基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段；质量要求：不高常规酶高保真酶：ExTaqLaTaq酶BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用Tris.cl提供缓冲作用(2)、dNTP的浓度：1常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性；2?4、影响PCR产量、质量的因素：3(1)、Taq酶：常用1U/25μL4?浓度低，扩增产物不够；5?浓度高，非特异性扩增增加；6?酶的活性；7影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性(5)、Mg2+浓度：常用mmol/L；对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.(3)、模板：主要考虑纯度及使用量μmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(4)、引物浓度：01(1)、变性温度和时间：要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃（2小时）95℃（40min）97℃（5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。02(2)、引物退火温度Tm与时间；Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃，G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒03(3)、引物延伸温度与时间：72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq04(4)、循环数：25-35cycles之间，过多则非特异扩增增加；平台效应；(6)、PCR反应程序设定：第二章?

基因工程操作的基本技术?DNA重组技术主要内容?核酸提取技术?凝胶电泳技术?PCR技术?核酸杂交技术?基因文库构建基因工程技术?重组子克隆基因工程的基本技术

之一第一节01?核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）;?脱氧核糖核酸（DNA）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。02一、核酸提取技术1、植物组织中基因组DNA的提取思考：DNA如何从细胞中取出？ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。再思考：1、研磨破碎组织必须在低温下进行。------为什么？2、幼嫩组织DNA的得率高还是低？防止DNA降解。得率高！ⅱ提取DNA的质量鉴定：DNA的相对完整性：凝胶电泳DNA的纯度：测OD值吸收峰：DNA紫外光260nm蛋白质紫外光280nm比值：OD260/280=1.8-2.0较纯OD260/2801.8-2.0杂质多2、质粒DNA的提取基因组DNA质粒DNA?质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。?质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。ⅰ质粒DNA提取方法：碱裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。、溶液Ⅰ：50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA(pH8.0)；、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS(w/