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基因工程的基本操作程序

原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等

原核细胞的基因结构RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。

真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。

真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子

原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的

基因工程的基本操作流程

基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库

基因组文库和部分基因文库

cDNA合成过程第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。

获取目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成

构建表达载体表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因

基因工程载体的构建需要考虑哪些因素（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。

转化:目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3、将目的基因导入受体细胞受体细胞种类方法植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物）基因枪法（单子叶植物）花粉管通道法显微注射技术：目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→新性状动物用Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法

思考：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

将目的基因导入受体细胞（动物细胞）显微注射法

将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）Ca2+处理

四、目的基因的检测与鉴定1、检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上2、检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质另外：个体生物学水平的鉴定

知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。

思考：检测mRNA是否合成，可以用分子杂交的方法吗？##检测目的基因是否翻译成蛋