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第十九章精液冷冻及精子库的管理

中南大学生殖与干细胞工程研究所

中信湘雅生殖与遗传专科医院

朱文兵

第一节精液冷冻

随着生殖工程技术的兴起及发展，供精人工授精（AID）已经成为治疗某些不可恢复或无法治疗的男性不育症的重要疗法，其中，精液冷冻是其中的重要环节，以下就精液冷冻的原理，影响因素、相关步骤及临床应用进行叙述。

一精液冷冻基本原理

在一定的低温条件下，以一定的时间作用于生物组织细胞，引起细胞的降温、凝固、非损伤性结冰，使生物体内分子运动的速度减慢、停止，从而使细胞代谢降低，处于休眠状态，达到贮存细胞的目的。细胞生活在细胞外液之中，细胞膜将细胞内容物（包括细胞内液）与细胞外部环境分隔开来，水分可以自由通过细胞膜，水分子从细胞内流向细胞外，或是从细胞外流向细胞内，主要取决于细胞内、外液中溶质浓度差，即溶液渗透压的高低。在细胞冷冻过程中，随着温度不断下降，细胞外液中，作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗粒状冰晶，导致细胞外水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，使细胞内外液渗透压失去平衡，水分将从渗透压低的内液通过细胞膜流向渗透压高的外液，于是细胞自身脱水皱缩。用冷冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，而不损伤细胞——这就是细胞冷冻贮存的基本原理。

由于冷冻降温速率的不同，冰晶的形成会造成细胞的损伤，如快速冷冻时，细胞冷冻太快，细胞内液来不及脱水，形成冰晶，破坏细胞内的超微结构称之为快速冷冻损伤；相反，在慢速冷冻时，细胞外液形成大量的冰晶，细胞外液渗透压突然升高，在尚未降到低温贮存温度前，细胞可能会由于过份暴露在高浓度溶质中或细胞严重脱水皱缩而死亡，称之为慢速冷冻损伤。

而冷冻保护剂由于其高水溶性，可保证在冰晶形成过程中，仍停留在溶液中不被析出，从而稀释细胞外液中溶质的浓度，延缓细胞外液的过分减少及浓度增加的时间，使得细胞顺利通过临界温度阶段。

二影响精液冷冻贮存的主要因素

影响人类精液冷冻贮存的因素主要有：冷冻程序、冷冻保护剂、复苏速率、贮存方式，及冷冻前精液质量等。

冷冻程序

精子在冷冻过程中，经过以下几个阶段，根据不同阶段的损伤程度采用不同的冷冻速度通过该阶段：①温度休克阶段，室温～5℃，此阶段细胞会遭受温度骤变造成的损害，可以1℃/min的速度通过该阶段；②冰晶潜热阶段，5～－5℃，该阶段中精浆形成冰晶，释放热量，温度升高，应快速通过该阶段；③冰晶形成阶段，－5～－15℃；④再结晶阶段，－15～－80℃，从－5～－30℃，尤其是－5～－15℃为致死温度范围，细胞内冰晶形成，温度骤变，往往会造成精子死亡，应以5～7℃/min的速度通过该阶段。⑤贮存阶段，－80～－196℃。

冷冻保护剂

（1）具备的基本条件：①对被冷冻的细胞无毒性；②具有高水溶性，保证在冰晶形成过程中不被析出。

（2）种类：①渗入性冷冻保护剂：甘油、DMSO、丙二醇等；②细胞外冷冻保护剂：蔗糖、卵黄等

（3）常用冷冻保护剂配方：

化学物质

用量

甘油（AR级）

14ml

5%葡萄糖溶液

26ml

2.9%枸橼酸鈉溶液

39ml

蛋黄

20ml

1g/L红霉素溶液

1ml

将左侧的这些溶液依次置于烧瓶中，搅拌均匀，以1mol/LNaHCO3调整PH值为7.2,配制的保护剂总量为100ml.配好后放－20℃保存，使用期为3个月；4℃冰箱保存，使用期为1周。

3.复苏速率

冷冻过程中，精子发生的一系列变化也会表现在解冻时的反向顺序中，而快速复温（100℃/min左右）可避免精液在溶解前的再次形冰晶成，具体步骤为：将贮存于液氮中的精液冷冻管取出，快速放入37℃的水浴箱中复温即可。

4.贮存方式

现在人们多使用液氮来贮存精液，液氮是一种无色、无味的气体，其沸点为－195.8℃。具有低温、不助燃、不自燃、不易爆炸、来源丰富的优点。其缺点为易蒸发、耗损量大，长期贮存精子时，必需定期添加液氮以补充蒸发的损失。而且，液氮气化后，体积会膨大655倍，因此盛放液氮的容器不能密封，以防放生爆炸。

5.冷冻前精液质量

一般而言，精液冷冻前的的活率及正常形态率越高，冷冻复苏后的精子活动率也越高，同时，由于个体差异的存在，不同人有不同的冷冻效果。

三精液冷冻步骤

1.基本仪器设备及材料

程序冷冻仪、超净工作台、相差显微镜、水浴箱、恒温培养箱、冰箱、酒精灯、培养皿、冷冻管、1ml注射器、冷冻保护剂

2.人类精液快速冷冻步骤

（1）精液取出后，在37℃的水浴箱中液化；

（2）精液液化后按照WHO的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录；

（3）镜检时将冷冻保护剂复温至室温；

（4）将精液与冷冻保护剂按1:1的比例