生物素亲合素放大技术.ppt

+A-EAg-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-EBAS实验方法及反应层次方法反应层次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-AB*C间接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-AB*C二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用BAS在ELISA中的应用生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定B2Y4A1固相化抗原或抗体3B5电化学发光免疫测定示意图用于终反应的放大三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用21BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离第十一章生物素-亲合素放大技术第一节生物素理化性质与标记生物素（biotin,B）是一种小分子生长因子,又称维生素H或辅酶R动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW244.31kD.1I环为咪唑酮环，可与亲合素结合2环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构3咪唑酮环4噻吩环5羧基6一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物01标记蛋白质氨基的活化生物素02标记蛋白质醛基的活化生物素03标记蛋白质巯基的活化生物素04标记核酸的活化生物素05生物素活化标记蛋白质氨基的活化生物素CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC生物素N-羟基丁二酰胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质如何减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离BDACE生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接除醛基外，BCHZ还可标记氨基主要用于标记偏酸性糖蛋白后，再与无水肼反应而成。标记蛋白质醛基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHOBNHS和BHZ可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；01一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性；02对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；03可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低；04二、生物素标记蛋白质选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。一、理化特性结构四亚基糖