高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物的方法.docxVIP

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高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物的方法

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是蜂蜡中16种磺胺类药物测定过程中的关键步骤，主要包括样品的采集、预处理和净化。在采集过程中，需注意避免污染，确保样品的代表性。预处理阶段通常包括样品的破碎、混合和均质化。对于蜂蜡样品，一般采用研磨机将样品研磨成粉末，然后使用均质器进行均质化处理，以确保样品的均匀性。

(2)预处理后的样品需要通过适当的净化步骤去除干扰物质，如蜂蜡中的杂质和色素。常用的净化方法包括固相萃取（SPE）、液-液萃取（LLE）和固相微萃取（SPME）等。以固相萃取为例，常用的SPE小柱材料有C18、ODS和CN等，具体选择取决于目标分析物的性质。在实际操作中，需要根据样品的基质特性选择合适的溶剂进行样品的溶解和SPE小柱的活化。例如，对于蜂蜡样品，通常使用甲醇或乙腈作为溶剂，以有效提取磺胺类药物。

(3)净化后的样品需要经过浓缩和复溶于合适的流动相中，以便进行HPLC-MS/MS分析。浓缩过程通常在旋转蒸发仪上进行，以去除大部分溶剂。浓缩后的样品需用流动相复溶，并通过0.22μm的滤膜过滤，以去除可能存在的微粒。例如，对于含有16种磺胺类药物的蜂蜡样品，通过上述前处理步骤，可以将目标分析物的回收率控制在80%至120%之间，满足定量分析的要求。在实际操作中，还需根据具体样品和目标分析物的特性对前处理步骤进行调整。

二、2.高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）条件

(1)高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）在蜂蜡中16种磺胺类药物的测定中，展现了高效、灵敏和准确的特点。在HPLC分析部分，采用反相色谱柱，如C18柱，作为固定相，以减少样品中的基质效应。流动相通常为水相与有机相的混合溶液，其中水相含有一定浓度的醋酸铵，有机相则为甲醇或乙腈。流动相梯度程序的设计对于提高分离效果至关重要，一般从初始比例的90%水相/10%有机相开始，在分析过程中逐渐增加有机相的比例至100%，保持数分钟后再返回初始比例。流动相流速控制在0.8-1.0mL/min，以实现快速的样品分析。

(2)在MS检测部分，采用电喷雾离子源（ESI）作为离子源，并设置多反应监测（MRM）模式，对每种磺胺类药物选择两个特异性强的母离子/子离子对进行定量。例如，磺胺嘧啶（SDZ）的母离子为m/z243.1，子离子为m/z179.1；磺胺二甲氧嘧啶（SDMX）的母离子为m/z259.1，子离子为m/z201.1。扫描范围为m/z100-800，以捕获所有目标分析物。在MS/MS模式下，碰撞能量（CE）设置为15-30eV，以优化子离子的信号强度。通过优化这些条件，可以实现目标分析物的高灵敏度检测，如磺胺嘧啶的检出限可达0.05ng/g。

(3)为了确保HPLC-MS/MS系统的一致性和可靠性，每次分析前应对系统进行空白测试和校准。空白测试可以评估溶剂和试剂对目标分析物的潜在干扰。在校准过程中，通常配制一系列已知浓度的标准溶液，涵盖定量限和10倍定量限（QEL）。在HPLC-MS/MS分析中，使用这些标准溶液进行校准曲线的制作，以确定目标分析物的浓度。例如，对磺胺类药物进行测定时，可以使用含有0.05ng/g、0.1ng/g、0.2ng/g、0.5ng/g和1ng/g标准溶液的混合溶液进行校准，得到线性响应曲线，相关系数（R2）应大于0.99。通过这些方法，确保了HPLC-MS/MS系统在测定蜂蜡中16种磺胺类药物时的准确性和可靠性。

三、3.分析方法与验证

(1)分析方法的验证是保证实验结果准确性和可靠性的重要环节。在验证蜂蜡中16种磺胺类药物的HPLC-MS/MS方法时，首先评估方法的线性范围和精密度。通过配制一系列标准溶液，包括低、中、高三个浓度水平，绘制校准曲线，考察其线性关系。结果显示，所有磺胺类药物的线性范围在0.05-1ng/g之间，相关系数（R2）均大于0.99。同时，进行日内和日间精密度实验，结果显示，各浓度的日内精密度和日间精密度均小于10%，表明该方法具有良好的精密度。

(2)稳定性实验用于评估样品、标准溶液和储备液在储存条件下的稳定性。实验结果显示，在室温下，样品、标准溶液和储备液在24小时内保持稳定，日内和日间精密度均小于10%。此外，样品在-20℃下储存，一周后进行检测，结果显示各磺胺类药物的回收率在90%-110%之间，表明该方法具有良好的稳定性。

(3)基质效应和选择离子检测（SIM）模式是评估HPLC-MS/MS方法准确性的重要指标。通过比较峰面积比值，评估基质效应的影响。实验结果显示，所有磺胺类药物的峰面积比值与标准溶液的峰面积比值基本一致，说明基质效应对检测的影响较小。同时，采用SIM模式进行检测，进一步