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乙肝五项操作规程
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)
操作步骤:
配液:配制工作浓度洗涤液(以纯化水做25倍稀释)
编号:将样品对应微孔按序编号(共预留阴性对照孔3孔、阳性对照1孔、建议预留空白对照1孔)
加样:加入75微升待测样本和阴、阳性对照与反应孔中。
温育:用封片纸覆盖反应板后,置37oc温育60分钟。
加酶标抗体:取出反应板,撕去封片,在已加入待测样本和阴性、阳性对照孔中加入50微升酶结合物。微孔振荡器或手工轻轻振荡10秒钟。
温育:用封片纸覆盖反应板后,置37oc温育30分钟。
洗涤:
手工:扣去孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置20秒,扣去洗涤液,重复5次在吸水纸上拍干。
洗板机:将孔内液体甩干。选择5次洗涤程序,洗板后在吸水纸上拍干。
显色:每孔加入显色剂A,B液各1滴(50微升),轻轻振荡匀,用封板纸覆盖反应板后,将反应板放置37oc孵化30分钟。
终止:每孔加终止液1滴(50微升),混匀。
测定:用酶标仪读数,波长450nm。(建议使用双波长的酶标仪比色,参考波长630nm或630相近的波长)若需扣除显色剂空白,则先用显色剂空白对照孔校零,然后读取各孔OD值。
结果判断
目测:在白色背景下观察各孔显色情况,有明显黄色者为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性;无色者为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性。
酶标仪检测:
临界值(CUT/OFF)计算:COV:Cut-offValue参考值
PC:阳性对照OD值
NCx:阴性对照平均OD值。
NCx=(NC1+NC2+NC3)÷3
检测有效性:NCx≤0.1、PC≥1.0,则检测结果有效。
COV=NCx+0.100
S:待测样品的OD值,S/COV:待测样本和COV的比值。
阳性判定:样品OD值S/COV≥1.0者判定为HBsAg阳性。
阴性判定:样品OD值S/COV1.0者判定为HBsAg阴性。
乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)
、操作步骤:
配液:浓缩洗涤液配置前充分混匀(如有结晶析出应充分溶解),将浓缩洗涤液(20*)用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。
编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂)
加样:分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴,阳对照50微升及质控血清。
加酶标抗体:空白对照孔不加酶标试剂,每孔加入酶结合物50微升,轻轻振荡混匀。
温育:置37oc温育30分钟。
洗涤:
手工:扣去孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置5秒,扣去洗涤液,重复5次在吸水纸上拍干。
洗板机:将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序,洗板后在吸水纸上拍干。
显色:每孔加入显色剂A,B液各1滴(50微升),轻轻振匀,37oc避光显色15分钟。
终止:每孔加终止液1滴(50微升),混匀。
测定:用酶标仪读数,取波长450nm(建议使用双波长的酶标仪比色,参考波长630nm)测定各孔OD值先用空白孔校零,然后读取各孔OD值。
结果判断
目测:
在白色背景下观察核孔显色情况,有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)阳性;无色者为乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)阴性。
酶标仪检测:
临界值(CUT/OFF)计算:COV=阴性对照平均OD值×2.1。(阴性对照孔OD值低于0.05者按0.05计算,高于0.05按实际OD值计算。
阳性判定:样品的OD值大于或等于COV值时,说明HBsAg阳性。
阴性判定:样品OD值小于COV值时,说明为HBsAg阴性。
乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)
操作步骤:
配液:浓缩洗涤液配置前充分混匀(如有结晶析出应充分溶解),将浓缩洗涤液(25*)用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。
编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂)
加样:将待测样本用生理盐水1:30稀释。(稀释样本检测结果为临床意义;样本原液加样,检测结果为流行病学意义。用户可根据实际情况选择。)分别在相应孔中加入稀释样本50微升和阴,阳对照50微升及质控血清。
加酶标抗体:空白对照孔不加酶标试剂,每孔加入酶结合物50微升,轻轻振荡混匀。
温育:置37oc温育30分钟。
洗涤:
手工:扣去孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置20秒,扣去洗涤液,重复5次在吸水纸上拍干。
洗板机:将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序,洗板后在吸水纸上拍干。
显色:每孔加入显色剂A,B液各1滴(50微升),轻轻振匀,37oc避光显色15分钟。
终止:每孔加终止液1滴(50微升),混匀。
测定:用于酶标仪读数,取波长450nm(建议使用双波长的酶标仪比色,参考波长630nm)测定各孔OD值先用空白孔校零,然后读取各孔OD值。
结果判断
目测:
在白色背景下观察核孔显色情况,有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体(H
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