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酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞

一、1.材料与试剂

(1)实验中所用小鼠由本实验室动物中心提供，均为清洁级昆明小鼠，体重20-25g，雌雄不限。实验前小鼠适应性饲养一周，确保动物状态良好。实验过程中，遵循动物实验伦理规范，对动物进行人道处理。

(2)试剂与耗材包括DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、EDTA、D-Hanks平衡盐溶液、细胞培养瓶、细胞培养板、超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液器、酶联免疫吸附检测仪等。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，青霉素-链霉素溶液和EDTA购自中国上海生工生物工程有限公司。

(3)实验前，所有试剂均需在适宜的条件下储存，确保其有效性。DMEM培养基和胎牛血清在购回后分别置于4℃和-20℃冰箱中保存。青霉素-链霉素溶液和EDTA使用时现配现用，以防止污染。所有实验用品在使用前均需进行消毒处理，以防止细胞污染。

二、2.动物来源及处理

(1)实验所用的昆明小鼠购自我国某知名动物实验中心，该中心拥有符合国家标准的动物实验设施，能够为科研提供高质量的实验动物。实验动物合格证号：SCXK（XX）2018-0001。实验前，对小鼠进行适应性饲养，饲养环境为温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%，光照周期12小时光照/12小时黑暗。饲养期间，每日观察小鼠的生长状况，记录其体重、活动情况和饮食情况。实验前，选取体重在20-25g的小鼠，雌雄比例约为1:1，以确保实验数据的可靠性。

(2)实验过程中，对小鼠进行麻醉处理，采用吸入式麻醉剂（异氟醚）进行麻醉，确保小鼠在实验过程中处于无痛苦状态。麻醉剂量为0.5-1.0%，通过麻醉机控制吸入量。麻醉成功后，对小鼠进行无菌手术操作，首先用碘伏消毒小鼠的腹部皮肤，然后进行无菌开腹手术，暴露主动脉。手术过程中，严格遵循无菌操作规程，防止感染。手术结束后，对小鼠进行缝合，并给予适当的抗生素预防感染。

(3)实验结束后，对小鼠进行解剖，取出主动脉，置于含有D-Hanks平衡盐溶液的器皿中，轻轻漂洗去除表面杂质。将主动脉剪成约1mm长的片段，放入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃水浴中消化30分钟。消化过程中，每隔5分钟轻轻摇动器皿，以确保消化均匀。消化结束后，将消化液过滤，收集滤液，加入适量的胎牛血清终止消化。最后，将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养，温度为（37±1）℃，二氧化碳浓度为5%，湿度为95%。培养过程中，定期观察细胞生长状况，记录细胞传代次数和生长曲线。通过实验，为后续研究提供可靠的小鼠主动脉平滑肌原代细胞。

三、3.小鼠主动脉平滑肌原代细胞的分离与培养

(1)在无菌操作条件下，将消化后的细胞悬液缓慢加入到含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，轻轻混匀，以终止消化过程。将细胞悬液通过200目细胞筛过滤，去除未消化的组织碎片。随后，将细胞悬液接种于预先铺有盖玻片的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养。培养箱温度设定为（37±1）℃，二氧化碳浓度为5%，湿度为95%。接种后24小时，显微镜下观察到细胞开始贴壁生长，细胞形态呈梭形或长方形。实验组小鼠主动脉平滑肌原代细胞接种后，细胞生长密度达到70%时进行首次传代。

(2)细胞传代时，先用D-Hanks平衡盐溶液轻轻洗去细胞上的培养基，然后用含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化细胞。消化时间控制在3-5分钟，以避免细胞过度损伤。消化结束后，加入适量DMEM培养基终止消化，收集细胞悬液，通过离心（1000rpm，5分钟）去除消化液，再用DMEM培养基重悬细胞。将重悬后的细胞以1:2的比例接种于新的培养瓶中，继续培养。在细胞培养过程中，定期观察细胞生长状态，记录细胞传代次数和生长曲线。本研究中，细胞传代次数控制在10代以内，以保证细胞生物学特性的稳定。

(3)在细胞培养过程中，对细胞进行形态学观察和免疫荧光染色。形态学观察显示，小鼠主动脉平滑肌原代细胞呈长梭形，细胞核清晰可见，细胞排列整齐。免疫荧光染色结果显示，细胞表达平滑肌肌动蛋白（α-Smactin）和细胞间连接蛋白（Cx43），证实了细胞的平滑肌特性。此外，本研究还通过流式细胞术检测了细胞的表面标志物，发现细胞表达CD45和CD31，进一步证实了细胞的来源。在后续实验中，我们将利用这些细胞进行相关功能研究，以期为心血管疾病的治疗提供新的思路。

四、4.酶联合消化法在培养过程中的应用

(1)在小鼠主动脉平滑肌原代细胞的分离过程中，我们采用了酶联合消化法，即胰蛋白酶和EDTA的联合使用。胰蛋白酶能够特异性地分解细胞外基质中的蛋白质，而EDTA则能够螯合钙离子，从而破坏细胞间的连接，使细胞易于从组织中分离。这种联