二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶（Rubisco）检测试剂盒实验解决方案.docx

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）检测试剂盒实验解决方案

原理

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco,EC4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性直接影响着光合速率。CheKine?二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本的Rubisco的活性，其原理是在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；在340nmNADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。

自备耗材

·酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）

·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

·制冰机、低温离心机、水浴锅

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

ExtractionBufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ExtractionBufferⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

WorkingReagentⅡ：临用前配制，对于48T，加5.5mLReagentⅠ溶解；对于96T，加11mLReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。

WorkingReagentⅢ：临用前配制，对于48T，加5.5mLReagentⅠ溶解；对于96T，加11mLReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。

WorkingReagentⅣ：临用前配制，对于48T，加0.6mLReagentⅠ溶解；对于96T，加1.2mLReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。

WorkingSolution：临用前将WorkingReagentⅡ和WorkingReagentⅢ按1:1混合，根据实验需求配制相应的体积。现用现配。

样本制备

粗酶液制备：

1.总Rubisco酶提取：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBufferⅠ，冰浴匀浆，超声波破碎1min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

2.胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBufferⅠ，冰浴匀浆，200g，4℃离心5min，弃沉淀，取上清，8,000g，4℃离心10min，离心后取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性，取沉淀加1mLExtractionBufferⅡ，震荡溶解后超声破碎1min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），8,000g，4℃离心10min，取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。

注意：建议测定总Rubisco酶活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤2提取粗酶液。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1.酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计用去离子水调零。

2.操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：

试剂

空白孔（μL）

测定孔（μL）

样本

0

10

去离子水

10

0

WorkingReagentⅣ

10

10

WorkingSolution

180

180

3.迅速混匀后于340nm检测，记录20s和5min20s的吸光值，测定孔的记为A1和A2，空白孔的记为A3和A4，计算ΔA测=(A1-A2)-(A3-A4)。

注意：空白孔只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.6，样本可用对应的ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A.使用96孔UV板测定的计算公式

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中，每mg组织蛋白在反应