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葡萄糖含量检测试剂盒实验解决方案

原理

葡萄糖（C6H12O6,FW:180.16）是一种主要的生物燃料源，用于产生通用的能量分子ATP。由于葡萄糖在代谢中的重要性，葡萄糖水平是许多代谢紊乱的关键诊断参数。葡萄糖水平异常与几种代谢功能异常有关，如低血糖、高血糖和糖尿病。组织和体液（如血液和尿液）中葡萄糖水平的测量通常用于诊断葡萄糖相关疾病。还监测血糖水平，以检查胰岛素和磺酰脲类药物在2型糖尿病中的疗效。CheKine?葡萄糖检测试剂盒（微量法）可检测血清、血浆、尿液、其他体液、食物、生长培养基等，其原理是改进的邻甲苯胺法，利用与葡萄糖的特定颜色反应，630nm处的吸光度与样品中的葡萄糖浓度成正比。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测630nm处的吸光度）及水浴锅

·96孔板或微量玻璃比色皿

·低温离心机、水浴锅

·可调节式移液枪及枪头

·去离子水、PBS

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

o-ToluidineReagent:即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：o-ToluidineReagent有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。

GlucoseStandard(300mg/dL):即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Standard设置：按下表所示，用去离子水将GlucoseStandard300mg/dL稀释为300、200、100、50、20、10、4mg/dL的标准溶液。

序号

300mg/dL标准品体积（μL）

去离子水体积（μL）

标准品浓度（mg/dL）

Std.1

150

0

300

Std.2

100

50

200

Std.3

50

100

100

Std.4

25

125

50

Std.5

10

140

20

Std.6

5

145

10

Std.7

2

148

4

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不能马上进行该项实验，样本可在储存-80℃一个月。

动物组织：称取约0.1g样本，加入1mLPBS，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心5min，取上清液，置冰上待测。

植物组织：称取约0.1g样本，加入1mLPBS捣碎，冰浴超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），12,000g，4℃离心5min，取上清液，置冰上待测。

细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mLPBS，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000g，4℃离心5min，取上清液，置冰上待测。

血浆，血清和尿液（和其他生物液体）：直接检测。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到630nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在EP管中操作）：

试剂

空白管（μL）

标准管（μL）

测定管（μL）

上清液

0

0

25

Standard

0

25

0

去离子水

25

0

0

o-ToluidineReagent

500

500

500

混匀，在沸水浴中加热8min，冷水浴（4℃）中冷却4min。取200μL到96孔板或微量玻璃玻璃比色皿，检测630nm处吸光值。空白孔记为A空，标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。

注意：空白孔只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA测高于300mg/dL标准品值，将样本用去离子水进行稀释后，再进行实验。结果需乘以稀释系数(n)。如果样本的ΔA测低于4mg/dL标准品值，可提高样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线。

Glucose浓度的计算

将样本的ΔA测代入方程得到y值（mg/dL）。

按样本鲜重计算

Glucose含量(mg/g鲜重)=y÷100×V样÷(W×V样÷V样总)×n=y÷100÷W×n

按样本体积计算

Glucose含量(mg/dL)=y×V样÷V样×n=y×n

按细胞或细菌数量计算

Glucose含量(mg/104)=y÷100×V样÷(500×V样÷V样总)×n=y÷50,000×n

V样：加入样本体积，0.025mL；100：1dL=100mL；W：样本质量，g；V样总：加入PBS体积，1mL；n：样本稀释倍数；50