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羟基抗氧化能力（HORAC）检测试剂盒实验解决方案

原理

羟基抗氧化能力（HydroxylRadicalAbsorbanceCapacity,HORAC）是一种检测各种样品中生物分子抗氧化能力的方法，可反映抗氧化剂转移羟自由基的能力。CheKine?羟基抗氧化能力（HORAC）检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞或细菌、血清（浆）等样本，其原理是以荧光素钠为荧光探针，芬顿反应产生羟自由基，根据羟自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化。抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。

自备耗材

·荧光酶标仪（激发波长为485nm，发射波长为525nm）

·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头

·低温离心机、恒温箱、制冰机

·去离子水、PBS(pH7.4)、丙酮

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

1×AssayBuffer：使用前，AssayBuffer(2×)用去离子水稀释成1×AssayBuffer，充分溶解待用。4℃保存。

1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×AssayBuffer稀释成1×ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。不要储存稀释的1×ReagentⅠ溶液。

1×ReagentⅡ：使用前，ReagentⅡ(32×)用去离子水稀释成1×ReagentⅡ，充分溶解待用。4℃避光保存。

注意：ReagentⅡ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

TroloxStandard(5mM)：使用前，用1×AssayBuffer稀释成0.1mM浓度，充分溶解待用。用不完的TroloxStandard（5mM）-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

序号

0.1mM标准品体积（μL）

1×AssayBuffer体积（μL）

标准品浓度（μM）

Std.1

80

120

40

Std.2

40

160

20

Std.3

20

180

10

Std.4

10

190

5

Std.5

5

195

2.5

Std.6

2.5

197.5

1.25

Std.7

0

200

0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存1个月。

1.动物组织：称取0.1g样本，加入1mL冷的1×AssayBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

2.植物组织：称取0.1g样本，加入1mL冷的1×AssayBuffer捣碎，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

3.细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL冷的1×AssayBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

4.血浆或血清：用1×AssayBuffer稀释10倍或更多进行检测。

5.液体样本：10,000g，4℃离心10min，去除微粒，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。

6.亲脂性样本：亲脂性样本溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀释，在室温下孵育1h，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。

7.固体或高蛋白样本：称取固体样本，加入去离子水（1:2，W/V），冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去离子水洗涤，将此洗涤液与水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×AssayBuffer稀释并直接用于分析。而不溶物部分加入纯丙酮（1:4,w/v）在室温下混合30-60min来进一步提取。10,000g，4℃离心10min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀释。通过将水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的结果相结合，计算出总HORAC值。

注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1501的测定。

实验步骤

1.荧光酶标仪预热到37℃，调节激发波长为485nm，发射波长为525nm。

2.操作表（