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过氧化氢酶（CAT）活性分析试剂盒实验解决方案

原理

过氧化氢酶（Catalase,CAT,EC1.11.1.6）是一种常见的抗氧化酶，可催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧，普遍存在于含有细胞色素系统的好氧细胞中。过氧化氢对细胞是高度有害的，其积累将导致细胞靶标（例如DNA，蛋白质和脂质）的氧化，从而导致诱变和细胞死亡。通过使用过氧化氢酶从细胞中去除过氧化氢（H2O2），可以防止细胞的氧化损伤。过氧化氢酶在氧化应激相关疾病中的作用已被广泛研究。过氧化氢酶还表现出过氧化活性，其中低分子量醇可用作电子供体。脂肪醇是过氧化氢酶的特异性底物，然而，具有过氧化活性的其它酶不利用这些底物。CheKine?过氧化氢酶(CAT)活性分析试剂盒（微量法），提供了一种简单易用的微量法，用于分析不同生物样品（血清、血浆、细胞/组织裂解液、生物液体）中过氧化氢酶活性。该检测试剂盒利用过氧化氢酶的过氧化物酶功能来测定过氧化氢酶的活性。在合适浓度的H2O2存在的条件下，过氧化氢酶与甲醇反应，产生甲醛，生成的甲醛可以与显色物反应，产物可以在540nm处测量吸光度，样本中的过氧化氢酶活性与OD值成正比。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·水浴锅，离心机

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

1×AssayBuffer:AssayBuffer(10×)用去离子水稀释至1×AssayBuffer。取2mLAssayBuffer(10×)加入18mL去离子水稀释至1×AssayBuffer，可在4℃保存至少两个月。

1×SampleDiluent:SampleDiluent(10×)用去离子水稀释至1×SampleDiluent。取5mLSampleDiluent(10×)加入45mL去离子水稀释至1×SampleDiluent，可用来稀释FormaldehydeStandards，Catalase(Control)和样本，可在4℃保存至少两个月。

1×LysisBuffer:Lysisbuffer(10×)用去离子水稀释至1×LysisBuffer。取5mLLysisbuffer(10×)加入45mL去离子水稀释至1×LysisBuffer，可在4℃保存至少两个月。

Methanol:即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

FormaldehydeStandard:即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：FormaldehydeStandard有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。

DilutedCatalase(Control):该瓶含有牛肝脏CAT粉末，作为阳性对照。用0.5mL1×SampleDiluent复溶并混合（复溶的酶可在-20℃保存一个月）。取10μL已经复溶的酶，用4.99mL1×SampleDiluent工作液稀释（稀释的酶可4℃保存30min）。

PotassiumHydroxide:即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

DilutedHydrogenPeroxide:用9.96mL去离子水稀释40μLHydrogenPeroxide。DilutedHydrogenPeroxide可于冰上保存2h。

Chromogen:即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

PotassiumPeriodate:即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：PotassiumPeriodate具有强氧化性，与可燃物料接触可能引起火灾。

标准品制备：用9.99mL1×SampleDiluent稀释10μLFormaldehydeStandard，得到4.25mM的储存液。按下表所示，进一步稀释标准品。

Standard

Formaldehyde(μL)

1×SampleDiluent(μL)

FinalConcentration(μMFormaldehyde)

1

4

996

2

2

10

990

5

3

30

970

15

4

60

940

30

5

90

910

45

6

120

880

60

7

150

850

75

注意：Finalformaldehydeconcentration是指在170μL反应体系里的终浓度。

样本制备

动植物组织：称取0.1g组织加入1mL预冷的1×Lysisbuffer将样本进行匀浆。匀浆后的样本，10,000g，4℃离心15min，取上清液做进一步分析。

细胞：收集5×106个细胞加入1mL预冷的1×Lysisbu