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还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒实验解决方案

原理

谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的天然三肽。在红细胞中，还原型谷胱甘肽是维持血红蛋白处于还原状态的关键，保护细胞免受氧化损伤。GSH是细胞中最重要的抗氧化剂巯基化合物，在细胞抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜转运中起重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。CheKine?还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（微量法）提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、血细胞、细胞及细菌中GSH的含量。DTNB与还原型谷胱甘肽反应生成黄色产物。在412nm处有最大光吸收，与样品中还原型谷胱甘肽的浓度成正比。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）

·水浴锅

·96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头

·低温离心机

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen：即用型；4℃避光保存。

标准品制备：

DilutedExtractionBuffer：ExtractionBuffer用去离子水稀释10倍。取200μLExtractionBuffer加入1,800μL去离子水，DilutedExtractionBuffer用于稀释标准品。

10mg/mLGSH标准品：每管用1mL去离子水溶解得10mg/mLGSH标准品，分装后-20℃，避光保存1个月。

标准品制备：使用10mg/mLGSH标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

序号

Standard(μL)

DilutedExtractionBuffer(μL)

Concentration(μg/mL)

Std.1

40μLof10mg/mLGSH

960

400

Std.2

100μLofStd.1(400μg/mL)

100

200

Std.3

100μLofStd.2(200μg/mL)

100

100

Std.4

100μLofStd.3(100μg/mL)

100

50

Std.5

100μLofStd.4(50μg/mL)

100

25

Std.6

100μLofStd.5(25μg/mL)

100

12.5

Std.7

100μLofStd.6(12.5μg/mL)

100

6.25

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。

动物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的ExtractionBuffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

植物组织：称取0.1g植物组织，加入1mL预冷的ExtractionBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清或血浆：将收集的抗凝血于600g，4℃离心10min，30min内吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的ExtractionBuffer，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血细胞：将收集的抗凝血于600g，4℃离心10min，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g，4℃离心10min），加入等体积ExtractionBuffer，混匀后4℃放置10min，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细胞或细菌：收集2×106个细胞（菌），首先用冷PBS清洗细胞（菌）2次（用PBS重悬，600g，4℃离心10min），加入3倍细胞（菌）沉淀体积的ExtractionBuffer重悬，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液做进一步分析。

注意：该试剂盒提取的样本也适用于氧化型谷胱甘肽（KTB1610）的检测。因ExtractionBuffer中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取相同样本，把