重组基因导入受体细胞.ppt

三、核酸分子杂交分析分子探针分子探针是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子或蛋白质分子。核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。分子杂交理想的探针标记物应满足的条件：标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特异性、杂交稳定性及酶反应待征等；检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；操作简便、省时．经济实用：化学稳定性高、易于长期保存；安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类。放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为常用。32P标记的核苷酸具由高放射性，放射自显影检测灵敏度高，但其分辨力低，半衰期短(14.3d)，探针不能长期保存。与32P标记物相比，35S的放射性较弱，检测灵敏度低，但其分辨力高，放射自显影的本底低，适于细胞原位杂交等。半衰期较长(87.1d)，辐射危害较小，使用较为方便安全。3H主要用于制备高分辨力的原位杂交探针，因其释放的放射能很低，放射自显影的本底也不高．但却需较长的曝光时间。半衰期长(12.35a)，标记探针可较长时间保存。标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。1.放射性标记物非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有生物素(biotin)标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸和荧光素(fluorescein)标记的核苷酸等。此外，乙酰基氨基芴(AAF)或乙酰基氨基碘芴(AAIF）、汞离子、金颗粒、银颗粒及磺基等标记的核苷酸也能作为标记物使用。2.非放射性标记物探针的标记有体内标记及体外标记两种方法。01体内标记法是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入3H-胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞DNA分子上。02体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。033.探针标记方法01020304包括化学法和酶法两种。常用的化学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和交叉相连法等。化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备非放射性标记物的探针。酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针。05常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记法、DNA末端标记法及PCR标记法等。体外标记(1)切口平移标记法DNA聚合酶Ⅰ该法标记模板链(2)随机引物标记法随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物。Klenow片段催化该法标记模板互补链随机引物：46使用随机引物标记的探针一般长400-600个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。21基本原理是：具有一定同源性的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段(称为探针)。(二)核酸探针杂交分析待测核苷酸序列(单链)核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链)Blot:是将待测生物大分子结合到一定的固相支持物上的方法。(这些结合在固相支持物上的生物分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。)固相支持物与有效的转移方法是此技术的成败关键。基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜(或尼龙膜)上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。01根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子