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小鼠骨髓染色体标本的制备

小鼠骨髓染色体标本的制备是一个复杂但重要的实验过程。

一、实验目的

通过制备小鼠骨髓染色体标本，可以观察和分析小鼠染色体的形态、结构和数目，进而研究遗传物质在细胞分裂过程中的变化规律和遗传特性。

二、实验材料

实验动物：小鼠

试剂：10%酵母葡萄糖溶液、秋水仙素、0.85%生理盐水、0.075mol/L氯化钾低渗液、固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）、Giemsa染液等

器材：离心机、载玻片、盖玻片、吸管、离心管、显微镜等

三、实验步骤

前处理：

在实验前24~36小时，按0.5ml/25g体重的剂量往小鼠腹腔内注射预温至37℃的10%酵母葡萄糖溶液，以促进小鼠骨髓细胞有丝分裂，提高骨髓细胞有丝分裂指数。

注射秋水仙素：

在注射酵母液2436小时后，往小白鼠的腹腔内注射秋水仙素，注射量按8.4ug/1g体重计算，或按4mg/kg动物体重的剂量注射0.1%的秋水仙素。注射后1012小时取材，秋水仙素可以抑制微管的聚合从而抑制纺锤体的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期。

取股骨：

用颈椎脱臼法或损伤脊髓法（如断颈法）处死小鼠。

立即用剪刀剪掉大腿上的皮肤和肌肉，暴露股骨及其两端相连的关节。

从肌骨两端关节头处剪下股骨，用卫生纸擦净股骨上残余的肌肉和血液。

收集骨髓细胞：

剪掉股骨两端膨大的关节头，暴露出骨髓腔。

用吸有适量生理盐水的注射器从股骨一端插入注射针头，将骨髓冲入10ml刻度离心管内，可反复冲洗数次，直至股骨变白为止。此时离心管中的细胞悬液可达68ml（或45ml）。

低渗处理：

将离心管平衡后放入离心机以1000rpm/min离心8分钟（或10分钟）。

吸去上清夜，留沉淀物。

加入6~8ml（或至8毫升刻度）0.075mol/L氯化钾低渗液（低渗液需先置37℃水浴箱内预温）。

用吸管将细胞团吹打均匀，置37℃水浴箱内低渗处理15分钟（或20~30分钟）。

预固定：

低渗处理完成后，立即加入1ml新配制的固定液。

混匀后以1000rpm/min离心8分钟。

固定：

吸去上清夜，加入固定液6~8ml（甲醇∶冰乙酸=3∶1）。

用吸管吹打混匀静置15分钟。

然后以1000rpm/min离心8分钟，吸去上清夜。

重复此步骤进行第二次固定。

制备细胞悬液：

吸弃上清夜后，视离心管底细胞沉淀量的多少而加入3~8滴固定液。

用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

滴片：

吸取细胞悬液滴到预冷的载波片上，每片滴2~3滴。

然后立即对准玻片吹一口气，使细胞悬液散开。

并迅速将玻片在酒精灯火焰上来回过几次以助染色体分散。

注意载玻片需经硫酸洗液浸泡10天以上，再用清水冲洗，最后用蒸馏水浸泡，并事先在冰箱中预冷。

染色：

将制备好并晾干的染色体标本片放在染色架上。

用吸管吸取Giemsa染液（用1ml原液加9mlpH6.8的PBS混合而成，现配现用）1~2ml滴到玻片上并使之铺展开。

染色5~10分钟（或20分钟），用自来水轻轻冲去染液，晾干待镜检。

四、实验结果与分析

制备好的小鼠骨髓染色体标本可以在显微镜下进行观察和分析。通过观察染色体的形态、结构和数目，可以了解小鼠的遗传特性、染色体变异情况以及可能存在的遗传疾病等。

五、注意事项

实验过程中要注意无菌操作，避免污染。

秋水仙素的注射时间需提前3~4小时，时间过长或过短均会影响染色体中期的数量和形态。

在低渗处理过程中，时间和吹打操作均至关重要。低渗过度会导致染色体膨胀、染色后显得肥胖；而低渗时间不足则会使染色体染色后颜色过深，无法清晰观察条带。

滴片时要注意细胞悬液的浓度和滴加的量，以及玻片的温度和干燥程度，这些都会影响染色体的分散和观察效果。

小鼠骨髓染色体标本的制备是一个需要精细操作和严格控制的实验过程。通过遵循正确的实验步骤和注意事项，可以成功制备出高质量的小鼠骨髓染色体标本，为后续的遗传学研究提供有力的实验依据。