从头合成茶氨酸的大肠杆菌工程菌株的构建.pdf

摘要

L-茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）是一种独特的非蛋白质氨基酸，几乎只存在于

茶树（Camelliasinensis）中，是绿茶鲜味的主要来源之一，因此茶叶中茶氨酸的含量

对茶叶的质量和价格具有较大影响。除具有较好的风味外，L-茶氨酸在多种动物模型

中表现出有益作用，如减少认知功能障碍、增强免疫力、抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等

多种作用。基于这些优势，L-茶氨酸被应用于食品、保健品和医药等领域中。

目前，利用γ-谷氨酰甲胺合成酶在大肠杆菌中通过外源流加乙胺可迅速的生产茶

氨酸，但乙胺沸点较低并且具有毒性，这使得在工业生产中需使用特殊设备，减少乙

胺对周围人员和环境造成的危害。为此，本研究利用代谢工程策略，构建了一株大肠

杆菌基因工程菌株，能够以葡萄糖为唯一碳源在不添加乙胺的情况下高效合成茶氨

酸。

本研究采用多模块代谢工程策略构建茶氨酸从头合成生产菌株。在大肠杆菌基因

组上多拷贝整合了来源于一株甲基营养菌（MethylovorusmaysNo.9）的γ-谷氨酰甲

酰胺合成酶基因gmasMm，提高了在外源添加乙胺的情况下茶氨酸的合成效率；引入

了一株枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis168）来源的丙氨酸脱氢酶alaD基因增强了乙

胺前体物丙氨酸的供应；以pTrc99a质粒为载体过表达C.sinensis来源的丙氨酸脱羧

酶alaDC基因，在细胞内构建了乙胺合成通路，从而实现了在不添加乙胺的情况下以

葡萄糖为碳源从头合成茶氨酸；敲除了茶氨酸降解基因ggt，减少了在发酵过程中茶

氨酸的消耗，并通过对质粒进行优化改善了丙氨酸脱羧酶基因的表达；过表达了来源

于青春双歧杆菌（Bifidobacteriumadolescentis）的磷酸解酮酶基因xfp，避免了丙酮酸

生成乙酰辅酶A过程中脱羧步骤带来的碳损失，过表达大肠杆菌自身来源的edd和

eda基因强化了丙酮酸的合成；引入了来源于产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimia

succiniciproducens）的磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因pckA增强了ATP的供应，最终获

得了高产茶氨酸的工程菌株。5L发酵罐发酵48h可产生92g/L茶氨酸，糖酸转化率

为32%，为目前报道的从头合成茶氨酸的最高水平。

关键词：L-茶氨酸；丙氨酸脱羧酶；乙胺合成途径；γ-谷氨酰甲胺合成酶

ABSTRACT

L-theanine(N-ethyl-γ-L-Glutamine)isauniquenonproteinaminoacid,whichalmost

onlyexistsintheteaplant(Camelliasinensis),andisoneofthemainsourcesofgreentea

flavor.Therefore,thecontentoftheaninehasagreatimpactonthequalityandpriceoftea.

Inadditiontoitsgoodflavor,L-theaninehasshownbeneficialeffectsinavarietyofanimal

models,suchasreducingcognitivedysfunction,enhancingimmunity,antioxidation,

anti-inflammatoryandanti-tumoreffects.Basedontheseadvantages,L-theaninehasbeen

appliedinfood,healthproducts,medicineandotherfields.

Currently,usingγ-Glutamylmethylaminesynthetasecanrapidlyproducetheanineby

exogenousadditionofethylamineinEscherichiacoli,butethylaminehasalowbo