免疫亲和—光化学柱后衍生高效液相色谱法测定乳制品中黄曲霉毒素.docxVIP

PAGE

1-

免疫亲和—光化学柱后衍生高效液相色谱法测定乳制品中黄曲霉毒素

一、1.方法原理与概述

1.免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱法是一种基于免疫学原理和色谱技术相结合的分析方法，主要用于乳制品中黄曲霉毒素的检测。该方法的基本原理是利用特异性抗体与黄曲霉毒素之间的免疫反应，将毒素从样品中分离出来。具体操作中，样品首先通过免疫亲和柱，使黄曲霉毒素与柱上的抗体结合，而其他杂质则被洗脱下来。随后，结合在抗体上的毒素经过光化学衍生化处理，提高其紫外吸收信号，便于后续的色谱检测。例如，黄曲霉毒素B1（AFB1）在衍生化后，其最大吸收波长可从原来的254nm提高到310nm，显著增强了检测灵敏度。

2.该方法具有较高的特异性和灵敏度。在优化条件下，免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱法对AFB1的检测限可达0.5ng/g，对AFM1的检测限可达1ng/g，远低于食品安全标准中规定的限量值（AFB1≤0.5ng/g，AFM1≤5ng/g）。在实际应用中，该方法已成功应用于多种乳制品，如牛奶、奶粉、乳酪等。例如，在对某品牌牛奶的检测中，该方法成功地从10份样品中检测出AFB1的浓度为0.3ng/g，符合食品安全标准。

3.在免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱法中，光化学衍生化是提高检测灵敏度的关键步骤。常用的衍生化试剂包括2,4-二硝基氟苯（DNFB）和邻苯二甲醛（OPA）。以DNFB为例，AFB1在DNFB的作用下，生成具有高紫外吸收特性的2,4-二硝基黄曲霉毒素B1，其最大吸收波长可达到310nm，显著提高了检测灵敏度。此外，该方法还具有操作简便、快速、准确等优点，适用于乳制品生产过程中的实时监控和质量控制。

二、2.仪器与试剂

1.免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱法测定乳制品中黄曲霉毒素所需的仪器主要包括高效液相色谱仪（HPLC）、荧光检测器、自动进样器、柱温箱、真空脱气机等。高效液相色谱仪应具备良好的分离性能和稳定性，如Waters2695型或Agilent1260型等。荧光检测器则是本方法的核心部件，它能够检测到衍生化后的黄曲霉毒素产生的荧光信号，如Waters2998型荧光检测器。自动进样器和柱温箱则确保样品能够精确、稳定地进入色谱系统，同时维持柱温在最佳状态。以Waters2695型高效液相色谱仪为例，其最高流速可达5ml/min，适合进行高灵敏度的分析。

2.在试剂方面，主要包括黄曲霉毒素标准品、免疫亲和柱、衍生化试剂、流动相添加剂等。黄曲霉毒素标准品需购买高纯度的产品，如Sigma-Aldrich公司提供的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1等。免疫亲和柱是本方法的关键，需选择与目标毒素亲和力强的产品，如Agilent的免疫亲和柱AFM1/AFB1。衍生化试剂主要包括2,4-二硝基氟苯（DNFB）和邻苯二甲醛（OPA），它们能够增强黄曲霉毒素的紫外吸收特性，提高检测灵敏度。流动相添加剂如磷酸、乙腈等，用于调节流动相的pH值和离子强度，确保色谱分离效果。以DNFB为例，其在衍生化过程中的使用浓度一般为0.1mg/ml。

3.实验室中还需准备一系列的辅助试剂和耗材，如超纯水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、无水硫酸钠、无水碳酸钠等。超纯水是保证实验结果准确性的关键，应采用反渗透或超滤等方法制备。甲醇和乙醇用于提取和清洗样品，无水硫酸钠和无水碳酸钠用于干燥样品和调节pH值。此外，实验过程中还需使用色谱柱、进样针、样品瓶、离心管等耗材。例如，在一项针对牛奶中黄曲霉毒素的检测实验中，研究人员使用了Waters2695高效液相色谱仪，AgilentAFM1/AFB1免疫亲和柱，以及Sigma-Aldrich公司提供的黄曲霉毒素标准品。实验过程中，超纯水用于制备流动相，甲醇用于提取样品，无水硫酸钠用于干燥样品。

三、3.实验步骤与结果分析

1.实验步骤首先包括样品前处理，取适量乳制品样品，加入一定量的提取溶剂，如乙腈，进行超声提取。提取完成后，将提取液通过无水硫酸钠柱进行干燥处理，去除溶剂，然后用流动相复溶于适宜体积的容器中。接下来，将处理后的样品溶液通过免疫亲和柱，使黄曲霉毒素与柱上抗体结合，其他杂质则被洗脱。此步骤通常需在室温下进行，流速控制在1ml/min。

2.在完成免疫亲和分离后，将结合在抗体上的毒素进行光化学衍生化处理。具体操作为，将毒素溶液与衍生化试剂混合，在特定条件下反应，如室温下反应30分钟。反应完成后，加入流动相，将衍生化后的毒素溶液通过C18色谱柱，进行色谱分离。色谱柱的温度设定在30℃，流速为1.0ml/min。收集特定波长下的荧光信号，通常为310nm。

3.结果分析部分，首先根据标准曲线计算样品中黄曲霉毒素的含量。标准曲线的制作需使用已知浓度的黄曲霉毒素标准品，在相同条件下进