酶工程实验生物工程.ppt

在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。PARTONE3.样品的处理将100ul蛋白样品与100ul样品处理液混合均匀，然后将此混合液在100摄氏度中水浴10min，冷却至室温后，12000rpm离心10分钟，即做成电泳样品。4.加样电泳按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。5.染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。6.脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。此方法检测灵敏度为0.2～1.0g。二.结果分析观察并记录实验结果，判断酶的纯度，拍出电泳酶纯度的检验结果。PART.01实验三酵母蔗糖酶的结晶

（蒸发和沉淀法相结合的悬滴蒸汽扩散结晶法）第一章节原理将含有一定盐浓度的缓冲液与含有低于这种盐浓度的蛋白质混合溶液在一个密封体系内一起蒸发扩散，最后达到平衡，使蛋白质溶液内盐浓度提高，而pH值接近待结晶蛋白质等电点的缓冲液又使中性盐对蛋白质的盐析作用更为显著，因此导致蛋白质溶解度降低，溶液逐渐达到过饱和而析出结晶。二、实验步骤用“吹气法”除去酒精泡洗后的24孔组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘，以防形成不必要的成核中心而影响晶体的观察。在24孔组织培养板的某孔中加入1mL含0.2mol/LNaCl的磷酸缓冲液（pH6.5）作为池液,孔边缘均匀涂抹上高真空油脂，勿使其进入孔内。PARTONE吸取1μL待结晶酶蛋白溶液置盖玻片中央,加等体积池液至此液滴中，用枪头轻轻地的吹吸液滴以保证混合液的均匀性并避免气泡出现。PARTONE小心、迅速地翻转盖玻片并盖在培养板的孔上,旋转45度以保证密封良好。室温下静置状态培养一周以上。实验结果一周后于体视镜下观察酵母蔗糖酶的晶体结构。实验四蔗糖酶酶学性质的研究一、实验原理酶学性质的研究包括：最适温度、最适pH、米氏常数、激活剂、抑制剂等。一般通过单因素实验确定。二、实验步骤2mol/L磷酸二氢钠052mol/L乙酸042mol/L柠檬酸032mol/L乙酸钠022mol/L磷酸氢二钠01配如下溶液：1、最适pH的测定（1）按下表配制缓冲溶液将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。溶液pH缓冲试剂体积ml缓冲试剂体积ml2.50.2mol/L磷酸氢二钠2.000.2mol/L柠檬酸8.003.00.2mol/L磷酸氢二钠3.650.2mol/L柠檬酸6.354.00.2mol/L乙酸钠1.800.2mol/L乙酸8.205.00.2mol/L乙酸钠7.000.2mol/L乙酸3.006.00.2mol/L乙酸钠9.500.2mol/L乙酸0.507.00.2mol/L磷酸氢二钠6.100.2mol/L磷酸二氢钠3.908.00.2mol/L磷酸氢二钠9.50.2mol/L磷酸二氢钠0.5样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电荷越多通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------