细胞因子药物分析.ppt

七、残余杂质检测工艺相关杂质是指生产过程中产生的杂质，如细胞基质(宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA)、细胞培养物(诱导剂、抗生素或培养基成分)或下游工序产生的杂质。1、对残余杂质进行限制的意义残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题；可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；反映产品生产工艺的稳定性。2、生产工艺相关杂质和污染物宿主细胞蛋白含量宿主细胞DNAIgG含量（10ng/剂量）蛋白A含量小牛血清残留量残余抗生素（氨苄西林）内毒素含量（LAL）污染物（1）宿主细胞蛋白含量以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用斑点免疫。常采用5种最常用的E.coli菌株混和作为ELISA测菌体蛋白含量的通用标准。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。来自E.coli菌株的产品为不大于0.1%；来自CHO细胞的产品为不大于0.05%。（2）宿主细胞DNA测定方法：采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNA标准品。宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素不作为一种危险因素。现行生物制品规程对宿主细胞DNA残留量标准作了相应调整：由小于100pg/剂量调整为小于10ng/剂量。（3）污染物产品污染物是指带入的外源性物质而不是生产工艺的一部分，如化学及生化物质(微生物蛋白酶)和/或微生物。应严格避免污染物，并用合适的认可标准或内控限值来控制其限度。外源性病毒和支原体污染。3、产品有关杂质产品相关杂质(如前体、某些降解产物)是在生产和/或贮存过程中产生的分子变异体，这些变异体在活性、有效性及安全性方面与预期产品相比，不占主导地位。细胞培养法中细胞染色标记方法3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖细胞数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗体发生反应。MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物MTTformazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测定MTTformazan的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接表示细胞的生长状态。AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。Crystalviolet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。 几种细胞培养测定方法比较 3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系统 线粒体电子传递系统 检出细胞的状态增殖 增殖、生存检出法 放射活性 色素、荧光 色素 色素、荧光抽出的必要性 + ++- 其他试剂的必要性+ ++ +- 成本（以MTT为1时） 6080-100（试剂盒）1 2缺点 使用同位素 不适合检出大量未增殖检出未增浮游细胞细胞，处理时费力殖活细胞