临床免疫学检验PPT课件 标记免疫技术.pptx

;标记免疫检测技术与经典免疫检测技术;罗莎琳·萨斯曼·耶洛

RosalynSussmanYalow

医学物理学家、放射免疫学家

1921—2011;标记免疫检测技术核心内容;第一节;掌握;PART

ONE;主要内容;第一节示踪物的种类及特性;二、荧光物质

荧光物质指一类可以接收光能发生能级跃迁，并在从激发态回复为基态时以发射光子释放能量的物质。;（一）荧光素

荧光素是指具有共轭双键的小分子化合物，可接收紫外光或蓝紫光的能量发生能级跃迁，并在从激发态回复为基态时发出荧光。

荧光素主要有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）等。;（二）稀土离子

镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽（Tb3+）、镝（Dy3+）等，Eu3+是标记抗原抗体应用最广的稀土元素。

游离的稀土离子在溶液中不稳定，且不易标记，因此常用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等螯合剂制备成稳定的镧系元素-螯合物。;通常用酸将镧系元素从标记用的螯合物上解离下来，再加入β-NTA或PTA等形成荧光强度更高的螯合物进行检测。;（三）荧光蛋白

荧光蛋白是一类在特定波长的光激发下可发射荧光的蛋白质。

在免疫检测中常的有藻红蛋白（PE）和多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）等。;其所产生的发射光强度一般较为弱，常采用光电倍增管进行检测。;吖啶酯发光反应;三联吡啶钌发光反应;四、酶及其常用底物

常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）等。

通过催化各自的底物产生可检测信号，进行定性、定量或定位分析。;（一）辣根过氧化物酶及其常用底物;（二）碱性磷酸酶及其常用底物;HRP催化鲁米诺发光;（三）β-半乳糖苷酶及其常用底物;五、纳米颗粒

纳米颗粒是指人工制造的，直径在纳米量级的微型颗粒。

作为示踪物的纳米颗粒主要分为两类：

具有颜色的纳米颗粒：胶体金、彩色乳胶颗粒等。

荧光纳米颗粒：量子点（quantumdots，QDs）、镧系元素掺杂的纳米颗粒等。

纳米颗粒常用于免疫层析检测技术，通过免疫反应在特定区域聚集并与邻近区域形成明显反差，可通过肉眼观察（具有颜色的纳米颗粒）或荧光读取装置（荧光???米颗粒）对结果进行判读。;胶体金;量子点;PART

TWO;主要内容;第二节示踪物与抗原抗体的结合物制备;（一）伯氨基

与伯氨基直接反应的官能团：;需活化后与伯氨基反应的官能团：;5.糖（残）基

其邻二羟基可在过碘酸盐（IO4?）的氧化下成为醛基，再通过醛基与伯氨基发生Schiff碱反应，并经硼氢化钠还原后形成稳定的共价键。;（二）巯基;二、示踪物与抗原抗体交联的基本方法

不同类型示踪物的性质及其制备方式的不同，其与抗原抗体进行交联反应的方式也存在不同，主要从以下几类进行介绍：

（一）放射性核素

（二）小分子化合物

（三）蛋白类示踪物

（四）纳米颗粒; ;（二）小分子化合物

包括荧光素、镧系元素螯合物、发光小分子等，其在合成时就可以考虑到后续的交联反应，一般会同时合成有交联活性的基团，如异硫氰酸酯、乙烯基砜或NHS酯等，可直接进行标记。

标记简单，先将抗原或抗体在标记缓冲液中稀释成合适浓度，再加入示踪物溶液混匀后反应一段时间即可。

需要注意的是，具有荧光性质或发光性质的小分子物质易发生光漂白或光分解，因此在标记时应避光反应。; ;HRP常用改良过碘酸钠法标记。HRP表面具有糖链，且表面氨基较少，是少有的可以采用过碘酸盐活化糖基进行标记的蛋白类示踪物。

HRP上的糖基被过碘酸钠氧化成醛基后，与抗原抗体上的伯氨基在碱性条件结合形成Schiff碱，再经硼氢化钠还原后形成稳定的共价标记物。

为了降低HRP在活化过程中的自交联情况，其过碘酸盐氧化常在酸性条件下进行，以维持HRP赖氨酸残基侧链上ε-氨基的质子化。活化后，迅速调节其溶液pH到碱性，再加入到碱性pH的抗原抗体溶液中进行交联反应。;大部分蛋白类示踪物可用戊二醛交联法标记抗原抗体。戊二醛交联法可分为一步法和两步法。

一步法是将蛋白示踪物、抗原（抗体）和戊二醛混在一起在碱性条件下反应。此法操作简单，但易发生蛋白示踪物自交联和抗原（抗体）自交联，标记效率低。

两步法是先将蛋白示踪物与过量的戊二醛反应，去除过量的游离戊二醛后，再加入抗原或抗体，形成蛋白示踪物-戊二醛-抗原（抗体）结合。两步法可以有效避免自交联的广泛发生，标记效率显著提高。;Sulfo-SMCC是一种常用的异型双功能交联剂，其分子中的琥珀酰亚胺酯可与伯氨基反应，马来酰亚胺可与巯基反应。

分子中的磺酸基（Sulfo—）主要是为了增加其可溶性。

一般而言，为了避免自交联和提高标记效率，Sulfo—SMCC先与需要标记氨基的蛋白反应，去除游离的Sul