棉花GhRCD1基因在Cd胁迫中功能及分子机制研究.pdf

摘要

随着全球工业和农业的快速发展，治理土壤重金属污染，保护有限的耕地资源，

保护粮食和食品安全，已逐渐成为全球性问题。重金属污染造成作物产量和质量的巨

大损失，通过食物链并威胁人类健康。植物修复是一种基于植物的、环境友好的、低

成本的原位方法，用于从农业或其他敏感土壤中去除重金属，基因改良在提高植物修

复效率方面发挥着重要作用。在植物修复治理土壤污染中，棉花作为不被食用的作物，

是吸附土壤中重金属的理想作物。不仅可以获得经济价值，也可以治理土壤重金属污

染。随着棉花基因组的解析和棉花高效遗传转化技术的更新，利用基因工程技术改良

棉花，使其成为修复土壤重金属污染的理想植物。本研究中通过对大量突变体Cd胁迫

响应的筛选，我们鉴定到一个Cd胁迫响应敏感的T-DNA插入突变体rcd1，GhRCD1

基因的表达受到抑制。通过遗传材料和生化实验研究棉花GhRCD1基因在重金属Cd胁

迫中功能及分子机制。主要研究结果如下：

1.我们首先通过水培的方式筛选到受重金属Cd胁迫响应的棉花T-DNA插入突变体

rcd1，发现rcd1突变体对Cd胁迫敏感。为了进一步确定GhRCD1的基因功能，我们

构建了过表达GhRCD1的重组载体和基因编辑敲除GhRCD1的载体，通过转基因技术

获得GhRCD1过表达株系和基因编辑敲除株系。在Cd胁迫处理下，GhRCD1过表达转

基因株系对Cd胁迫与野生型相比更加耐受，GhRCD1敲除株系对Cd胁迫更加敏感。

表明GhRCD1基因正调节棉花对Cd胁迫的响应。

2.为了研究GhRCD1参与棉花Cd胁迫响应的调控通路，本研究筛选到一个互作蛋白

GhbHLH12，我们利用酵母双杂交等实验均证明GhRCD1与GhbHLH12蛋白存在互作

关系。为了确定GhbHLH12的基因功能，我们同样的构建了过表达GhbHLH12的重组

载体，RNAi干涉GhbHLH12的重组载体和基因编辑敲除GhbHLH12的载体，通过转

基因技术获得GhbHLH12过表达株系，干涉株系和基因编辑敲除株系。Cd胁迫表型分

析表明，与野生型相比，GhbHLH12干涉转基因株系和基因编辑敲除株系对Cd胁迫更

加耐受，GhbHLH12过表达转基因株系对Cd胁迫更加敏感。表明GhbHLH12基因负

调控棉花对Cd胁迫的响应。

3.为了进一步研究GhRCD1互作蛋白GhbHLH12下游的靶标基因及其功能分析，我们

利用酵母单杂交实验，凝胶滞缓实验（EMSA）和荧光素酶瞬时表达实验均证明

GhbHLH12蛋白和GhMYB44的启动子之间存在互作关系。为了确定GhMYB44的基因

功能，我们同样的构建了过表达GhMYB44的重组载体和SRDX-GhMYB44的重组载体，

通过转基因技术获得OE-GhMYB44和SRDX-GhMYB44转基因株系。Cd胁迫表型分析

表明，与对照相比，GhMYB44过表达转基因株系对Cd胁迫更加耐受，SRDX-

GhMYB44转基因株系对Cd胁迫更加敏感。表明GhMYB44基因正调控棉花对Cd胁迫

的响应。

4.为了更进一步研究GhbHLH12下游靶标基因GhMYB44的互作蛋白及其功能验证，

我们利用酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验均证明GhMYB44与GhPYL8蛋白存

在互作关系。为了确定GhPYL8的基因功能，我们同样的构建了过表达GhPYL8的重

组载体并且进行遗传转化，Cd胁迫处理后，发现GhPYL8过表达转基因株系对Cd胁

迫更加耐受。GhPYL8过表达转基因株系的内源ABA含量增加。表明GhPYL8基因正

调控棉花对Cd胁迫的响应。

5.为了更进一步研究GhMYB44下游靶标基因及其功能分析，我们利用DAP-seq技术

发掘GhMYB44下游的候选靶标基因。然后我们利用酵母单杂交实验，EMSA和荧光

素酶瞬时表达实验均证明GhMYB44蛋白和GhHMA1/5的启动子之间存在互作关系。

为了确定GhHMA1的基因功能，我们利用VIGS技术培育沉默GhHMA1的植株

TRV:GhHMA1。Cd胁迫表型分析表明，与空载体植株相比，TRV:GhHMA1沉默植株

对Cd胁迫更加敏感。表明GhHMA1基因正调控棉花对Cd胁迫的响应。