微生物发酵漆酶蛋白初步分离与制备实验报告.docx

AHPU-BioSection

《生物分离工程综合实验》

实验报告

2023—2024第2学期

专业班级：

学生姓名：

学号：

指导教师：

完成日期：2024.6.20

微生物发酵漆酶蛋白初步分离与制备

XXX

（安徽工程大学生物与食品学院，安徽芜湖241000）

摘要：本实验为：微生物发酵漆酶蛋白初步分离与制备。在实验过程中，通过发酵培养获得含漆酶的发酵原液。随后将发酵原液进行离心或过滤进行实验预处理，去除可能含有的菌丝体、培养基残渣等不溶物，从而得到漆酶粗提液S1。随后在粗提液S1中加入硫酸铵，使漆酶蛋白沉淀析出，并将沉淀后的溶液进行离心，收集漆酶蛋白沉淀，再将收集的漆酶蛋白沉淀利用磷酸缓冲液进行复溶，得到复溶液S2。然后通过膜透析去除小分子杂质和盐离子，得到透析液S3。再通过冷冻干燥步骤除去透析液中的水分，获得冻干制品，进一步纯化漆酶蛋白，再使用磷酸缓冲液复溶得到复溶液S4。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对所有的溶液样品S1,S2,S3,S4进行跑凝胶电泳，测定不同样品蛋白质的分子量大小。在每一步实验过程中需要对所有样品的酶活力以及蛋白质含量进行测定。最后经检测获得的所需漆酶，纯度较高，活力和含量达到预期。

关键词：漆酶;盐析；真空冷冻干燥；SDS；

实验背景简介

漆酶是由真菌、细菌、植物和昆虫等来源产生的一种含铜的多酚氧化酶，根据来源的不同可大致分为：植物漆酶、动物漆酶和微生物漆酶[1]。同时漆酶是一种绿色生物催化剂,能够催化木质素、酚类、胺类等芳香族化合物或其他部分非酚化合物的氧化降解,最终将分子氧还原成水而不产生其他副产物。由于对底物的广泛适用性和催化过程的无毒害性,漆酶被广泛用于木质纤维素的预处理、食品加工、有机合成、环境有毒难降解物的治理等诸多领域[2]。基于漆酶介导酚类化合物氧化耦合与降解反应的双功能机制，成功地被应用于生物修复、纸浆漂白、染料脱色、染料合成和纤维改性等生物技术领域。

本实验结合了《生物分离工程》教学内容和实验开展要求，选取变色栓菌发酵制备漆酶原液，利用了盐析，透析，冷冻干燥等分离纯化操作对漆酶进行初步分离与制备的系列实验，通过本次实验使学生掌握常规分离技术的基本原理和实验操作技能，使学生们加深对《生物分离工程》这门学科的认识，对于该门课程学习的重要性。同时在实验过程中培养学生实验动手能力、数据分析能力，团队协作能力和理论应用于实践的能力。

在本次微生物发酵漆酶蛋白的初步分离与制备实验中，预期能够获得高纯度、高活力的漆酶蛋白，并通过脱色实验验证了其在实际应用中的效果。这些结果将为漆酶的进一步研究和工业化应用提供有力的支持。

实验材料和设备

实验材料

由生物工程教研室提供的变色栓菌漆酶发酵原液。

实验试剂

具体主要试剂配制方法及说明如下表1所示。

表SEQ表\*ARABIC1主要实验试剂配方及说明

试剂

用途

配制浓度

配制方法

注意事项

盐酸溶液

溶解酪蛋白、调节pH、盐酸稀释液（0.1-0.2mol/L）母液

1mol/L

计算摩尔浓度，用去离子水配制

浓盐酸挥发、腐蚀性强，注意安全

愈创木酚

漆酶底物

1.0mmol/L

计算摩尔浓度，用去离子水配制

磷酸缓冲液（pH=7.2）

酶催化反应缓冲液、底物溶解液、样品稀释液

0.1mol/L

取Na2HPO4·12H2O32.3g和NaH2PO4·2H2O4.5g。将上述试剂加入约800毫升的水中，搅拌溶解。使用HCl或NaOH调节溶液的pH值至7.2。补加蒸馏水至总体积为1000毫升，混匀即可。

先配制两种母液再混合。注意母液的配比比例关系。最终pH也可以使用两种母液进行调整。

硫酸铵溶液

在盐析过程中，沉淀样品中的蛋白质

依据实验需求调整

固形物形式直接加入酶液

逐渐、缓慢加入

SDS

考马斯亮蓝G250

与蛋白质特异性结合并显色，用于测定蛋白质浓度

0.1g/L

准确称取0.1g考马斯亮蓝G250，溶50mL95%乙醇,100mL85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容至1000mL。

考马斯亮蓝G250溶液的用量500mL足够。

实验设备

冷冻干燥机、数显恒温水浴锅、磁力搅拌器和离心机等、培养箱、电泳仪、冰箱、分光光度计、容量瓶、烧杯、移液管、EP管、离心管等。

实验方法与结果分析

实验预处理（所得上清液为S1）

3.1.1方法步骤

1.本次实验3个成员组为一组，取20mL漆酶发酵液用离心机在4000rpm的转速下离心15min，收集上清液，并测量所得到的上清液的体积、酶活和蛋白含量，在测定酶活力和蛋白质含量时可能需要适当稀释，可经过预实验估算稀释倍数。

2.漆酶活力的测定：

以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50m