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高效液相色谱法定量分析食用油中的黄曲霉毒素B_(1)

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是高效液相色谱法定量分析食用油中黄曲霉毒素B1的关键步骤之一。首先，需对样品进行适当的预处理，以确保黄曲霉毒素B1的有效提取和分离。通常，食用油样品经过均质化处理，以破坏油脂的稳定性，提高黄曲霉毒素B1的提取效率。具体操作中，将食用油样品与一定比例的有机溶剂（如乙腈或甲醇）混合，在高速匀质器中进行均质化处理。例如，在分析某品牌花生油时，取20g样品，加入80mL乙腈，于高速匀质器中以10,000r/min的速度匀质化2分钟。

(2)均质化后，样品通常需要通过液-液萃取或固相萃取（SPE）等方法进行净化。液-液萃取法是将均质化后的样品与另一种有机溶剂（如正己烷）混合，充分振荡后静置，使黄曲霉毒素B1等脂溶性物质转移到正己烷相中，然后取正己烷相进行浓缩和测定。以某批次玉米油样品为例，经过液-液萃取后，黄曲霉毒素B1的提取回收率可达90%以上。而在固相萃取法中，样品通过填充有特定吸附剂的SPE小柱，利用吸附剂对黄曲霉毒素B1的选择性吸附作用，实现样品的净化。例如，使用C18小柱对橄榄油样品进行固相萃取，黄曲霉毒素B1的净化效率可达到95%。

(3)净化后的样品需进行适当浓缩处理，以降低样品基质的影响，提高检测灵敏度。常用的浓缩方法包括旋转蒸发和氮吹等。以某品牌葵花籽油样品为例，经过液-液萃取和固相萃取后，样品在旋转蒸发仪中于40℃下浓缩至近干，然后用流动相复溶于1mL溶液中，以便进行高效液相色谱分析。此外，为避免样品在浓缩过程中发生降解，可在浓缩过程中加入一定量的稳定剂，如抗坏血酸等。

二、2.高效液相色谱仪（HPLC）条件优化

(1)在高效液相色谱法（HPLC）分析食用油中黄曲霉毒素B1时，色谱柱的选择至关重要。常用的色谱柱为C18反相色谱柱，其具有较高的分离效率和重现性。以某品牌橄榄油样品为例，选用4.6mm×250mm，5μm粒度的C18色谱柱，流动相为乙腈-水（体积比80:20），流速为1.0mL/min，柱温设定为30℃。在此条件下，黄曲霉毒素B1与其他杂质的分离度可达1.5以上，满足定量分析要求。

(2)流动相的选择和配比对黄曲霉毒素B1的分离效果有显著影响。实验表明，在乙腈-水体系下，加入一定比例的冰乙酸或磷酸盐缓冲溶液，可以有效改善峰形，提高分离度。例如，在乙腈-水（体积比80:20）的流动相中加入0.1%的冰乙酸，黄曲霉毒素B1的峰形更加尖锐，峰面积稳定，重现性良好。此外，流动相的pH值对黄曲霉毒素B1的保留时间也有一定影响，通常将pH值控制在3.0-4.0之间。

(3)柱温对黄曲霉毒素B1的分离效果同样具有显著影响。实验表明，在30℃的柱温下，黄曲霉毒素B1的保留时间适中，峰形尖锐，分离度较高。当柱温升高至40℃时，黄曲霉毒素B1的保留时间明显缩短，但分离度有所下降；而当柱温降至25℃时，黄曲霉毒素B1的保留时间延长，峰形变宽，分离度降低。因此，在实际操作中，应根据具体样品和色谱柱的特性，选择合适的柱温。

三、3.黄曲霉毒素B1的检测与定量方法

(1)黄曲霉毒素B1的检测通常采用高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）方法。样品经过前处理和净化后，使用流动相将黄曲霉毒素B1从基质中洗脱，通过C18色谱柱分离。检测过程中，流动相中的黄曲霉毒素B1在荧光检测器下发出特定波长的荧光信号，通过检测该信号强度，可以实现对黄曲霉毒素B1的定量分析。例如，在检测某批玉米油样品时，使用乙腈作为流动相，荧光检测波长为365nm。

(2)在定量分析过程中，通常需要建立标准曲线以确定黄曲霉毒素B1的浓度与荧光强度之间的关系。通过配制一系列已知浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，分别进行HPLC分析，记录荧光强度，以浓度对荧光强度绘制标准曲线。实际样品中黄曲霉毒素B1的浓度可以通过比较样品的荧光强度与标准曲线上的对应浓度来确定。

(3)定量分析时，还需考虑样品的提取回收率和检测限。提取回收率是衡量前处理方法有效性的重要指标，通常要求黄曲霉毒素B1的提取回收率在70%-120%之间。检测限是指能够检测到的最低黄曲霉毒素B1浓度，一般要求检测限在1ng/g以下。通过优化前处理方法和色谱条件，可以保证样品的提取回收率和检测限满足食品安全标准的要求。

四、4.数据分析及质量控制

(1)数据分析过程中，首先需要对色谱图进行定性分析。通过比较样品色谱峰的保留时间、峰面积和荧光强度等参数与已知黄曲霉毒素B1标准品的特征，可对样品中的黄曲霉毒素B1进行定性。例如，在检测某品牌花生油样品时，样品色谱峰的保留时间与黄曲霉毒素B1标准品的保留时间一致，且峰面积比值在1.2-1.8之间，荧光强度比值为0.95-1.05，因此可确