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山药种薯（苗）病毒RT-PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了山药种薯（苗）病毒RT-PCR检测技术的术语和定义、检测对象、抽样、RT-PCR检测方法、种薯（苗）质量标准等。

本标准适用于山药种薯（块茎、零余子）、种苗病毒的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T402脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程

NY/T1212马铃薯脱毒种薯繁育技术规程SN/T2964植物病毒检测规范

SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范

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术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。3.1

反转录PCRReversetranscriptionPCR

指一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。3.2

带毒率Virus-carryingrate

指各级别山药种薯（苗）受病毒侵染薯块（植株）比率。

4检测对象

中国淮山药坏死花叶病毒（Chineseyamnecrosismosaicvirus，简称CHYNMV）日本淮山药花叶病毒（Japaneseyammosaicvirus，简称JYMV）

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山药温和花叶病毒（Yammildmosaicvirus，简称YMMV）马铃薯M病毒（PotatovirusM，简称PVM）

菜豆萎焉病毒（Beanwiltvirus，简称BBWV

5抽样

5.1脱毒组培苗抽样

每个茎尖分生组织培养系均应检测。

5.2田间抽样

5.2.1原原种田和原种田抽样

甩蔓期、开花期、收获前2w，采用五点法取样，抽样标准见表1。每株取茎蔓上、中、下部叶片1g~5g。将第一次抽取的样品混合后，原原种抽取20%以上（含）样品进行检测。原种抽取10%以上（含）的样品进行检测。

表1抽样数量标准表

田块面积（hm2）

抽样量

抽样最低量（株）

面积≤0.1

40株/点

200

0.1hm2＜面积≤1hm2

100株/点

—

面积＞1hm2

按0.1hm2＜面积≤1hm2划区，500株/区

—

5.2.2生产用种田抽样

开花期及收获前2w，取样检测。抽样标准见表2。每株取茎蔓上、中、下部叶片1g~5g。将第一次抽取的样品混合后，抽取5%以上（含）样品进行检测。

表2抽样数量标准表

种薯（苗）总量，株

抽样百分率，%

抽样最低数量，株

≤10000

6~10

100

10000

3~5

—

5.3没有经过田间检测的种薯、零余子、种苗检测

抽样数量标准见表3。将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取5%以上（含）的样品检测。

表3抽样数量标准表

种类

种薯（苗）总量

抽样百分率，%

抽样最低数量

种薯

≤10000kg

6~10

100kg

10000kg

3~5

—

零余子

≤100kg

3~5

1kg

100kg

1~2

—

种苗

≤10000株

6~10

100株

10000株

3~5

—

注：不足抽样最低数量的全部作为混合样品。

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6RT-PCR检测方法

6.1样品处理

取样叶片、块茎、零余子等组织100mg，置于研钵中，加液氮研磨至粉末状。

6.2总RNA提取

用植物RNA提取试剂盒提取样品的总RNA，具体提取步骤按照相应说明书进行。

6.3TR-PCR

以实验室保存的标准CHYNMV、JYMV、YMMV、PVM和BBWV病毒总RNA为阳性对照，以健康山药叶片或块茎或零余子总RNA为阴性对照，采用特异性引物对待测样品进行检测，具体引物序列见附件B。扩增过程按照RT-PCR一步法试剂盒说明书操作，反应在50μL体系中进行，各组分如下：2×1StepBuffer25μL、PrimeScript1StepEnzymeMix2μL、上下游各1μL、TotalRNA模板1μL，加RNaseFreeddH2O至50μL。扩增程序：50℃反应30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，53~60℃退火30s（病毒引物对应的退火温度见附件B），72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

6.4PCR产物电泳检测

取扩增样品5μL，加入1