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斑海豹肠道微生物菌群检测与健康评估技术规程

1范围

本标准规定了斑海豹（Phocalargha）的来源、取样方法、检测方法，健康评估。

本标准适用于斑海豹主管部门、科研院所、水族馆等可进行斑海豹救助和饲养的机构。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

SC/T9606斑海豹饲养规范

SC/T6073水生哺乳动物饲养设施要求SC/T9409水生哺乳动物谱系记录规范SC/T9411水生哺乳动物饲养水质

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1野生斑海豹

指分布在我国黄、渤海海域的斑海豹。

3.2豢养斑海豹

指在水族馆、动物园、救助机构等人工饲养条件下生活的斑海豹。

3.3斑海豹年龄

指斑海豹从出生时起到计算时止生存的时间长度，通常用年岁来表示。小于1岁为幼崽，1～2岁为幼年，2～3岁为青年，4岁以上为成年。

3.4肠道微生物菌群

指肠道环境中存在的微生物群落，是其中生存的全体微生物的集合。

4斑海豹来源

应符合SC/T9606的相关规定。豢养斑海豹应符合SC/T6073和SC/T9411的相关规定。

5取样方法

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5.1样本要求

采集斑海豹的粪便作为样本。豢养斑海豹样本应在90天内未服用过抗生素类药物。

5.2取样

5.2.1粪便样本应新鲜，未粘水，无尿液混杂。

5.2.2豢养斑海豹粪便样本应在干燥区上采集。

5.2.3野生斑海豹粪便样本应在海水落潮时采集。

5.2.4取样量5g以上，装入密封袋、塑料管等无菌容器中。

5.3保存

取样后应低温保存，-20℃条件下可保存7天。-80℃条件下可长期保存。

6检测方法

6.1DNA提取

6.1.1采用DNA试剂盒提取基因组DNA。

6.1.2采用琼脂糖凝胶电泳检验提取DNA的完整性。

6.1.3成功提取的DNA，测定其浓度和纯度，并于-20℃条件下保存。6.216SrRNA基因扩增

6.2.1使用341F-806R引物扩增DNA样本中的16SrRNA基因，扩增反应为25μL体系。

6.2.2PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

6.2.3双链DNA定量试剂盒测定回收PCR产物的浓度，等量混合样品的PCR产物。

6.2.4DNA文库构建试剂盒构建测序文库，使用Illumina平台进行测序。

6.3物种分类学鉴定

6.3.1使用QIIME软件对测得序列进行质量控制，得到高质量的序列。

6.3.2将高质量的序列按照97%的相似性进行聚类，每一个聚类代表一个细菌属。

6.3.3使用QIIME挑选每一个聚类的代表序列，与Greengenes数据库比对进行物种分类学注释。

6.3.4根据注释后每一个物种的序列数目计算其丰度。

7健康评估

7.1行为指标

7.1.1摄食状态，如摄食量、食物吞咽速率、捕食活鱼状态等。

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7.1.2呼吸、游泳、潜水和在陆上运动的能力。

7.1.3听觉和视觉无功能性障碍。

7.2生理指标

7.2.1体温范围为35.3℃~37.4℃。

7.2.2生长速率应符合SC/T9606的相关规定。野生和豢养斑海豹未知年龄个体参照斑海豹生长速率推算获得。

7.2.3血常规、血生化指标参见附录A。

7.2.4肠道微生物菌群指标参见附录B。菌群结构异常可能导致的疾病和治疗药物参见附录C。

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附录A（资料性附录）

斑海豹血常规和血液生化指标参考范围表A.1斑海豹血常规指标参考范围

参数

参考范围

参数

参考范围

幼崽

成体

幼崽

成体

白细胞数/×109个.L-1

6.77~18.69

5.78~14.78

血红蛋白/g.L-1

白细胞数/×109个.L-1

6.77~18.69

中性粒细胞百分比/%

31~66

36~73

红细胞压积/%

中性粒细胞百分比/%

31~66

淋巴细胞百分比/%

21~59

14~55

平均红细胞体积/fL

淋巴细胞百分比/%

21~59

单核细胞百分比/%

2~8

2~12

平均血红蛋白含量/pg

单核细胞百分比/%

2~8

嗜酸细胞百分比/%

0~6

0~7

平均血红蛋白浓度/g.L-1

嗜酸细胞百分比/%

0~6

红细胞数/×1012