DB50T 1254-2022 山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法　　.docxVIP

ICS11.220

CCSB41

DB50

重庆市地方标准

DB50/T1254—2022

山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法

2022-06-01发布2022-09-01实施

重庆市市场监督管理局发布

I

DB50/T1254—2022

前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：重庆市畜牧科学院、西南大学、重庆市酉阳土家族苗族自治县畜牧产业发展中心。

本文件主要起草人：陈静、叶超、方仁东、何玮、徐远东、范彦、黄德均、赵金红、孙晓燕、黎年富。

1

DB50/T1254—2022

山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法

1范围

本文件规定了山羊地方性鼻内肿瘤病毒EvaGreen荧光定量PCR检测方法的缩略语、原理、试剂和耗材、仪器和设备、样品采集、运输与保存、操作步骤、结果判定、实验室生物安全要求等内容。

本文件适用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

cDNA互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA）

Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold）DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

ENTV-2山羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzooticnasaltumorvirus2ofgoats）gDNA基因组DNA（genomicDNA）

gDNase基因组脱氧核糖核酸酶（Genomicdeoxyribonuclease）PBS磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSolution）

PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）qPCR荧光定量PCR（QuantitativePCR）

RNA核糖核酸（RibonucleicAcid）

5原理

2

DB50/T1254—2022

根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因特定的序列设计合成一对特异性引物，该对引物能针对ENTV-2目的基因进行扩增，产生双链DNA片段，在qPCR反应体系中加入的EvaGreen荧光染料能与双链DNA片段结合而产生荧光信号，通过检测PCR反应液中的荧光信号强弱，实现对目的基因的准确定量。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

6试剂和耗材

6.1除特别说明外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。

6.2RNA提取试剂：Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、DEPC水，或其他同等效果的商品化试剂盒。

6.3反转录试剂：5×gDNABuffer（含gDNase）、FQ-RTPrimerMix、FastKingRTEnzymeMix、10×KingRTBuffer；或其他同等效果的商品化试剂盒。

6.4反应液：EvaGreen荧光定量PCR反应液。

6.5特异性引物：ENTV-2-F：GAGGCAAATTGAGGCGTTGAT；ENTV-2-R：CCCGTTCTGCATTCG-CTGTAG（靶序列见附录A）。

6.6阴性对照：DEPC水。

6.7阳性对照：质粒pMD-19T-ENTV-2。

6.8PBS溶液：按照GB/T22915中PBS溶液配制的规定执行。

6.91.5mL离心管（无RNA酶）。

6.100.2mLPCR管。

6.11医用棉签。

7