蛋白定量与纯度分析.ppt

浓度测量的相对误差与溶液透射率(T)的关系如图所示：图1第31页，共52页，星期日，2025年，2月5日3.2比色测定呈色反应在定量分析中，有许多物质的测定是通过化学反应生成颜色后再进行比色测定，一般要注意下列问题(1)颜色反应后的生成物必须在选定测定波长有较大的光吸收(2)颜色反应后生成物理化性质必须稳定，显色条件容易控制，重复性好(3)对照性好，反应物和生成物之间的最大吸收波长之差，差值一般要在60nm以上。第32页，共52页，星期日，2025年，2月5日3.3参比溶液的选择根据样液的性质不同，可选择不同的参比溶液。(1)溶剂参比：当样液的组分比较简单，与其它组分共存对所测定波长无任何吸收剂为参比。(2)溶液参比：参与反应的试剂在所测定波长部分干扰，可按照显色反应的条件，选用不加被测试样品的溶液为参比。(3)纯水参比：试样与共存组分在测定波长均有较大的吸收，可选用水为空白，先测出试样和对照的光吸收值，然后用试样的吸收值减去对照的光吸收值即可。第33页，共52页，星期日，2025年，2月5日.4定量分析小结方法机理关键技术优点缺点比色法光互补色呈色反应应用广泛影响因素多紫外法最大吸收峰蛋白质纯度操作简单基准物有局限定氮法转化氮元素蛋白质消化结果准确步骤繁琐重量法冰点升华样品恒重结果准确专一性差第34页，共52页，星期日，2025年，2月5日第二节蛋白质纯度1概念1.1蛋白质纯度蛋白质的纯度分析，是从蛋白质样品中确定目标蛋白和杂质的分析方法，也是蛋白质分析中的一类重要方法。任何一个蛋白质制品从理论上说都含有二类组分，即蛋白质和杂质。蛋白质：是样品中主要的成分，是分析的目标蛋白杂质：是残留的非目标蛋白和残留的小分子，无机盐等因此，蛋白质纯度分析方法大致分为两类。第35页，共52页，星期日，2025年，2月5日(1)目标蛋白与杂蛋白的分析(2)目标蛋白与非蛋白的分析从广义上说蛋白质纯度一般是指样品中是否含有杂蛋白的，不包括无机盐和有机小分子的分析鉴定。因为有些蛋白质要在一定无机盐和有机小分子的保护下才比较稳定。因此，某些产品中要添加一些小分子化合物。但是如果要进行蛋白质的含量测定，则要包括杂蛋白，无机盐和有机小分子的测定。第36页，共52页，星期日，2025年，2月5日1.2蛋白质纯度的表示方法一个天然蛋白或一个重组蛋白质，产品的纯度是一个重要的指标。纯度的表示方法主要根据实际用途区分。如化学试剂的纯度一样，主要有化学纯，分析纯，优级纯等。蛋白质的纯度通常有两种方式表示。(1)工业用的用百分含量表示：如：95％、99％、99.9％(2)实验室用的以用途表示：有实验室级纯(1ab)电泳纯(electrophoresis)色谱纯(choromatography)。第37页，共52页，星期日，2025年，2月5日2分析的方法：2.1光谱法：2.1.1光谱扫描法：一种纯度的蛋白质溶液在一定的波长范围内进行光谱扫描就会得到一个特征吸收光谱，可以根据扫描光谱的吸收曲线的形状，吸收峰的位置，数量和大小判断该蛋白的纯度。用紫外吸收光谱测定样品的纯度，既方便又灵敏，测得结果可靠，是常用的纯度分析方法。光谱分析的特点：主要是鉴别目标蛋白质和非蛋白类杂质。第38页，共52页，星期日，2025年，2月5日关于蛋白定量与纯度分析第1页，共52页，星期日，2025年，2月5日第一节蛋白质定量分析1概况1.1蛋白含量蛋白质定量分析通常是指测定蛋白质溶液中的蛋白质的量或蛋白质粉剂中蛋白质的量。在进行蛋白质含量测定时，首先根据蛋白质的物理化学性质的特性和实验室的现有条件来确定测定方法。蛋白质含量测定方法有很多，大致可以分为四类，重量法定氮法比色法氨基酸推算法等第2页，共52页，星期日，2025年，2月5日采用的测定方法不同得到的测定结果有差异。每-种方法有它独特的优点，但是也有它的局限性。。在上述几种测定方法中测定的数据最准确的，最可靠的属于定氮法和氨基酸推算法。这两种测定方法都是通过测定分子中的氮元素或分子结构来确定蛋白质含量的。因此，测得的数据相对比较准确，但是它的实验步骤比较多，操作比较繁琐。其他的测定方法相对简单一些，是实验室常用的技术，灵敏度相对低一些。测定蛋白质含量通常要采用两种以上的方法，要根据蛋白质的某些特性选择不同的方法进行测定。将多种方法测得的结果综合考虑。第3页，