3D打印支架联合双交联免疫调节水凝胶治疗大鼠临界性骨缺损的研究.pdfVIP

摘要

3D打印支架联合双交联免疫调节水凝胶治疗大鼠临界性骨缺损

的研究

摘要

研究目的：

本研究基于3D打印聚己内酯（PCL)支架联合甲基丙烯酰化丝素蛋白（SFMA）

/甘草酸（GA）双交联水凝胶制备具有骨免疫微环境调节作用的多功能复合支架，

并对该复合支架进行表征、生物相容性评估、体内外免疫调节能力和成骨性能等

一系列研究，为该复合支架最终能应用于临界性骨缺损的临床治疗提供理论基础

和实验依据。

研究方法：

1、复合支架的制备和表征

将SFMA、GA、硫酸锌（ZnSO）和光引发剂(LAP)在85℃下混合搅拌制备成

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SGZ水凝胶。采用熔融沉积3D打印技术制作PCL支架，冷却后冻干备用。将碱

处理后的PCL支架浸入纳米羟基磷灰石（Hap）/乙醇溶液中，得到PH支架，将

制备好的SGZ水凝胶填充到PH支架中并利用405波长紫外光进行二次交联后得

到SGZ@PH复合支架。利用利用扫描电镜（SEM）、能谱仪（EDS）、X射线光电子

能谱分析（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振氢谱（1H-NMR）和水

接触角（WCA）测试仪对支架形貌、成分和物理性能进行分析。

2、体外实验

按不同处理分为空白对照组、PCL组、PH组、SGZ@PCL组和SGZ@PH组。通过

活/死染色和CCK-8实验评估复合支架的生物相容性。利用DCFH-DA荧光探针检

测支架对细胞内ROS的清除能力。利用小鼠来源的巨噬细胞（Raw264.7）与支架

共培养，并用脂多糖(LPS)诱导M1巨噬细胞极化，利用逆转录-聚合酶链反应

（RT-qPCR）研究巨噬细胞相关基因的表达，细胞分组爬片后利用免疫荧光研究

相关抗原的表达，以评估复合支架免疫调节功能。将骨髓间充质干细胞(BMSC)

与不同组支架共培养后进行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色，研究体外

成骨能力，并进行转录组测序，研究相关基因的表达。

3、体内实验

利用SD雄性大鼠作为研究对象。麻醉后，于大鼠颅骨双侧钻取两个直径5mm

的颅骨缺损，植入相应支架。分别饲养4、8周后处死，采用micro-CT评价骨缺

损周围骨组织生成情况，取组织切片进行HE、Masson染色评估新骨形成情况，

利用免疫荧光染色评估复合支架的成骨、免疫调节能力。

结果:

1、EDS能谱显示Hap颗粒成功负载于PCL支架。XPS、FTIR、1H-NMR结果显

I

摘要

示Hap制备成功。SEM、EDS、XPS、1H-NMR等结果显示水凝胶制备成功并成功于

支架表面进行二次交联。WCA显示疏水的PH支架在加载水凝胶后亲水性显著提

高，有利于细胞的生长粘附。

2、体外研究：活/死染色结果表明所有支架组的存活细胞比例较对照组差异

无统计学意义。DCFH-DA荧光显示对照组具有较强的ROS荧光，而含有抗氧化水

凝胶的支架则可以显著降低BMSC胞内的ROS水平。RT-qPCR结果显示含有水凝

胶的支架中M2巨噬细胞标志物CD206和ARG-1标记物表达显著升高，而M1表型

相关基因iNOS表达则显著降低，表明复合支架具有免疫调节功能，细胞爬片免

疫荧光结果也佐证了这一结论。ALP染色结果显示负载Hap的支架在培养7天和

14天后染色最深，相对于其他处理组表现出更好的成骨矿化能力，而其他支架

处理组与对照组对BMSC的成骨效果无明显差异。qRT-PCR结果表明含有负载Hap

的支架成骨基因明显上调，证实这些支架促进成骨分化的能力。转录组测序结果

显示复合支架能够通过促进矿化通路和抑制促炎通路来发挥作用。

3、体内研究：micro-CT及相关定量分析结果显示含有Hap涂层的支架骨缺

损周围骨组织的生成情况最好，其中加载了水凝胶的PCL-Hap支架显示出最好的

促成骨修复能力。HE染色和Masson染色图像显示复合支架组新骨形成较多。缺

损处组织切片免疫荧光染色显示复合支架具有较好的免疫调节及促成骨能力。

硕士研究生：黄瑞鹏