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糖化酶活性检测试剂盒实验解决方案

原理

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。CheKine?糖化酶活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和培养细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活性。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管

·水浴锅、低温离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。（若出现沉淀，可以90℃加热5min溶解后使用）

ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ReagentII有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Standard：临用前配制；加入1mLExtractionBuffer溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃保存2周。

标准品制备：使用10mg/mL葡萄糖标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号

Standard体积（μL）

去离子水体积（μL）

浓度（mg/mL）

Std.1

200μL10mg/mLStandard

800

2.0

Std.2

150μLofStd.1(2.0mg/mL)

50

1.5

Std.3

300μLofStd.1(2.0mg/mL)

300

1.0

Std.4

320μLofStd.3(1.0mg/mL)

80

0.8

Std.5

200μLofStd.4(0.8mg/mL)

200

0.4

Std.6

200μLofStd.5(0.4mg/mL)

200

0.2

Std.7

200μLofStd.6(0.2mg/mL)

200

0.1

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞3min（功率30%或300W，超声3s，间隔7s），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在1.5mL离心管中操作）：

试剂

空白孔（μL）

标准孔（μL）

测定孔（μL）

对照孔（μL）

样本

0

0

10

0

灭活样本

0

0

0

10

Standard

0

10

0

0

去离子水

10

0

0

0

ReagentⅠ

100

100

100

100

充分混匀，放入40℃水浴20min

ReagentII

90

90

90

90

充分混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录540nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。

注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.05可适当加大样本量。如果ΔA测定大于2mg/mL的ΔA标准，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用